CCK-8-Kit (Zellprogramm und Toxizitätstest)

Das Cell Counting Kit-8, kurz CCK-8 Kit, ist eine Alternative zur MTT-Methode und ist ein schnelles, hochempfindliches Test-Kit, das auf WST (wasserlösliches Tetrazol-Salz, chemischer Name: 2-(2-Methoxy-4-Nitrophenyl)-3-(4-Nitrophenyl)-5-(2,4-Disulfobenzyl)-2H-Tetrazol-Mononatriumsalz) basiert, das weit verbreitet für Zellprogramm und Zytotoxicität verwendet wird. Kann für Tests wie Medikamentescreening, Zellprogrammametrie, Zytotoxizitätstest, Tumorensibilität und andere verwendet werden.

Gebrauchsanweisung:
Erstellen einer Standardkurve (bei der Bestimmung der spezifischen Anzahl von Zellen)
1. Zählen Sie zuerst die Anzahl der Zellen in der hergestellten Zellsuspension mit der Zellzählplatte und impfen Sie die Zellen.
2. Verhältnismäßig in der Folge mit dem Medium und anderen Verhältnissen zu einem Zellkonzentrationsgradient verdünnt, in der Regel 3-5 Zellkonzentrationsgradiente, jede Gruppe 3-6 Komplexporen.
3, nach der Impfung in die Zellwand kultiviert, dann CCK-8 Reagenz-Kultur nach einer bestimmten Zeit, um den OD-Wert zu bestimmen, um eine Standardkurve mit der Zellzahl als horizontale Koordinate (X-Achse) und OD-Wert als longitudinale Koordinate (Y-Achse) zu erzeugen. Diese Standardkurve ermöglicht es, die Anzahl der Zellen in unbekannten Proben zu bestimmen (diese Standardkurve wird unter der Voraussetzung getestet, dass die Bedingungen für das Experiment konsistent sind, um die Anzahl der Impfungen und die Kultivzeiten nach der Zugabe von CCK-8 zu bestimmen). ）

II. Testen der Zellaktivität

Impfen Sie eine Zellsuspension in einer 96-Loch-Platte (100 µL/Loch). Die Platte wird in einem Kühlraum vorkultiviert (bei 37 ° C, 5% CO2).

Fügen Sie 10 µL CCK-8-Lösung zu jedem Loch hinzu (achten Sie darauf, dass keine Blasen in dem Loch entstehen, sie können die OD-Werte beeinflussen).

Inkubieren Sie die Platte für 1-4 Stunden in der Kultivkammer.

Messung der Absorption bei 450 nm mit einem Enzym-Skalierer.

Wenn die OD-Werte vorübergehend nicht bestimmt werden, können 10 µL 0,1 M HCl oder 1% SDS (W/V) Lösung in jedes Loch hinzugefügt werden und die Platte unter Raumtemperatur verdeckt werden. Die Absorption ändert sich innerhalb von 24 Stunden nicht.

Zellwertschöpfung - Toxizitätstest

Konfigurieren Sie 100 µL Zellsuspension in 96-Loch-Platten. Die Platte wird 24 Stunden (bei 37 °C, 5 % CO2) in der Kühlkammer vorkultiviert.

2. Fügen Sie der Kultivplatte 10 µL unterschiedliche Konzentrationen zu testenden Substanz hinzu. Inkubieren Sie für eine geeignete Zeit (z. B. 6, 12, 24 oder 48 Stunden) in der Kultivküche.

Fügen Sie jedem Loch 10 µL CCK-8-Lösung hinzu (achten Sie darauf, dass keine Blasen in dem Loch entstehen, sie können die OD-Werte beeinflussen). Wenn die Substanz oxidativ oder reduktiv ist, kann ein frisches Medium vor der Zugabe von CCK-8 ersetzt werden (das Medium entfernt und die Zellen zweimal mit dem Medium gewaschen und dann ein neues Medium hinzugefügt), um die Wirkung des Arzneimittels zu entfernen.

Inkubieren Sie die Platte für 1-4 Stunden in einem Koffer.

5. Messung der Absorption bei 450 nm mit einem Enzym-Scaler.

Wenn die OD-Werte vorübergehend nicht bestimmt werden, können 10 µL 0,1 M HCl oder 1% SDS (W/V) Lösung in jedes Loch hinzugefügt werden und die Platte unter Raumtemperatur verdeckt werden. Die Absorption ändert sich innerhalb von 24 Stunden nicht.

Berechnung der Vitalität:.

Zellivalität (%) = [A (Dosierung) - A (Leere)] / [A (0 Dosierung) - A (Leere)] x 100

A (Dosierung): Absorptionsgrad von Löchern mit Zellen, CCK-8-Lösungen und Arzneimittellösungen

A (Leere): Absorption von Löchern mit Medium und CCK-8-Lösung ohne Zellen

A (0 Dosierung): Absorptionsgrad von Löchern mit Zellen, CCK-8-Lösung ohne Medikamentlösung

Zellstärke: Zellprogrammstärke oder zytotoxische Wirksamkeit

Hinweis:

① Es wird empfohlen, zuerst mehrere Löcher zu machen, um die Anzahl der impften Zellen und die Kultivzeit nach der Zugabe des CCK-8-Reagents zu ermitteln.

Weiße Blutkörperchen können länger kultiviert werden.

Bei Verwendung einer Standard-96-Loch-Platte beträgt die Mindestmenge an Impfstoffen für Wandzellen mindestens 1.000 Stück/Loch (100 µL Medium). Die Empfindlichkeit bei der Erkennung von weißen Blutkörperchen ist relativ gering, so dass die empfohlene Impfmenge nicht weniger als 2.500 Stück / Loch (100 µL Medium) ist. Wenn Sie ein 24-Loch-Platten- oder 6-Loch-Platten-Experiment verwenden möchten, berechnen Sie zuerst die entsprechende Impfmenge pro Loch und fügen Sie eine CCK-8-Lösung zu 10% des Gesamtvolumens des Mediums pro Loch hinzu.

Wenn kein 450 nm Filter vorhanden ist, können Filter mit einer Absorption zwischen 430 und 490 nm verwendet werden, aber 450 nm ist die höchste Erkennungsempfindlichkeit.

5 Die Absorption von Phenol-Rot im Medium kann bei der Berechnung durch Abzug der Absorption des Grundes in einem leeren Loch entfernt werden, so dass es keine Auswirkungen auf die Detektion hat.