Biologische Reagenzien

Einer,Brongen Test KitEigenschaften:

(1) Sie benötigen nur 1 μl Zellstoff und 1 Wasserbad, keine Extraktion von Genomdna, kein Fluoreszenzmikroskop, PCR-Gerät, Elektrophorese, Gelbildgerät, Bioluminescenzdetektor und andere komplexe experimentelle Ausrüstung;

(2) nur 1h Ergebnis, einfache, schnelle und empfindliche Zellbranchen-Testmethode;

(3) nur einen Schritt Operation, um das gesamte Experiment abzuschließen, das Experimentergebnis ist intuitiv leicht zu erkennen, basierend auf der Farbe der Reaktionsflüssigkeit, ohne Elektrophoresis, um das Risiko der falschen positiven Eröffnung des Deckels durch mehrstufige Operationen zu vermeiden;

(4) Die Empfindlichkeit ist weit höher als die PCR-Methode und kann eine Vielzahl von Branchen erkennen, die in Zellkulturen üblich sind (Schweinennasa-Branchen, Jing-Amin-Branchen, Mund-Branchen, Lecher-freie Gallosteroide, Fermentierungs-Branchen, Speichel-Branchen, humane Branchen, Birnen-Branchen, die 98% der Branchen-Kontamination ausmachen).

Zwei,Brongen Test KitZusammensetzung (25T):

3. Experimentelle Schritte:

(1) Zu testende Zellkulturflüssigkeit

Die zu testende Zelle nimmt das Volumen der Zellkultur von 200 μl oder mehr nach 2-3 Tagen und der Schmelzgehalt erreicht am besten mehr als 80%, folgt 200 g Zentrifugierung für 5 Minuten und nimmt dann die Klärung für die nachfolgende Prüfung (nehmen Sie nicht 50 μl Kultur und Zellfällung auf dem Rohrbund);

(2) Zusammensetzung des Reaktionssystems (Lösung A, Lösung B, positive Kontrolle, Paraffinöl sofort auf Eis nach dem Auftauen und Schmelzen platziert)

Entfernen Sie die Lösung A von -20 ° C, bis sie aufgefroren und geschmolzen ist und mischen Sie leicht umgekehrt nach oben und unten. Entsprechend der Anzahl der zu testenden Zellproben wird das folgende Reaktionssystem in einer Spurenzentrifuge zusammengestellt (der Prozess der Reaktionssystemzubereitung wird sehr wichtig auf Eis durchgeführt);

Hinweis: Jedes Experiment erfordert eine negative Kontrolle, eine positive Kontrolle und aufgrund eines Pipettenfehlers wird die Prüfung von N Proben in der Regel empfohlen, N + 3 der oben genannten Reaktionssysteme zu verarbeiten.

Vorsichtig mit einem Schüttelgerät vermischen und dann in ein PCR-Röhrchen aufteilen (200 μl Volumen-PCR-Röhrchen empfohlen), in denen 24 μl der oben genannten vermischten Reaktionsflüssigkeit pro Röhrchen aufgeteilt werden;

(3) Oberprobe (es ist sehr wichtig, den gesamten Oberprobenprozess auf Eis zu halten, insbesondere das über der Reaktionsflüssigkeit bedeckte Paraffinöl muss auf Eis gekühlt werden)

Prüfprobe: 1 μl zu messende Zentrifuge in das Reaktionsrohr hinzugefügt, um die Kultivflüssigkeit zu reinigen, und dann mit dieser Flüssigkeitsgeschütze nach oben und unten bewegen, um 5 Mal sanft zu blasen;

Negative Kontrolle: keine Proben hinzufügen oder 1 μl steriles Wasser hinzufügen;

Positive Kontrolle: Fügen Sie 1 μl positive Kontrollprobe hinzu und bewegen Sie sich mit dieser Flüssigungspistole vorsichtig nach oben und unten, um 5 Mal zu blasen;

Dann fügen Sie 25 µl Paraffinöl vorsichtig über jede Reaktionsrohrlösung hinzu (in einem Wasserbad reagiert), um zu verhindern, dass die Flüssigkeit verdampft, was zu ungenauen Ergebnissen führt. Achten Sie beim Hinzufügen von Paraffinöl darauf, den Pistolenkopf jedes Mal zu ersetzen, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu verhindern. Wenn die Reaktion in einem PCR-Gerät durchgeführt wird, ist kein Paraffinöl erforderlich.

4) Reaktion

Setzen Sie die Temperatur des Wasserbadetopfes oder des PCR-Instruments auf 61 ° C und legen Sie es in ein Reaktionsrohr und inkubieren Sie es für 60 min;

Hinweis:

Die tatsächliche Temperatur des Wasserbadetopfes kann von der Einstellungstemperatur abweichen, es wird empfohlen, zuerst mit einem Thermometer zu kalibrieren. In der Tat können 59-63 ° C-Reaktionen durchgeführt werden, beeinflussen aber die Detektionsempfindlichkeit;

2Das Reaktionsprodukt darf nicht geöffnet werden, sonst führt das erzeugte Aerosol zu einer nachfolgenden Detektion von falschen Positiven. Es wird empfohlen, das Reaktionsrohr in Plastikbeutel oder Handschuhe zu verpacken, in einen speziellen Mülleimer zu werfen und rechtzeitig zu reinigen;

Es wird nicht empfohlen, einen Ofen oder ein Metallbad für eine Heizreaktion zu verwenden.

5) Ergebnis Urteil

Nach 60 min Reaktion bei 61 ° C wird das Reaktionsrohr sofort entnommen und auf Raumtemperatur gelegt. Beobachten Sie die Reaktionsergebnisse in einer gut beleuchteten Umgebung (auf weißem Papier als Hintergrund empfohlen). Wenn die Reaktionsflüssigkeit bleibt blau violett, wird sie als negativ bestimmt; Wenn die Reaktionsflüssigkeit himmelblau ist, wird sie als positiv eingestuft.

4. Verwandte Literatur

1, ShiyuHe, YanzhiHuang, YanlingZhao. AReverseTranscription-PolymeraseSpiralReaction(RT-PSR)-BasedRapidCoxsackievirusA16DetectionMethodandItsApplicationintheClinicalDiagnosisofHand,Foot,andMouthDisease. FrontiersinMicrobiology.2020; 12(11):734-743.

2, AudreyJean, FlorenceTardy, OmranAllatif. Beurteilung der Mykoplasma-Kontamination von Zellkulturen durch qPCRusin durch ein universelles Primerpaar mit 1,5 kb-Fragment von 16SrRNA-Genen. PLOSONE.2017; 12(2):e0172358.

3、ZohreSoheily, MohammadSoleimani, Keivan Majidzadeh-Ardebili. Erkennung von Mycoplasma-Kontamination von Zellkultur durch Loop-Mediated Isothermal Amplification Methode. CellJ.2019; 21(1):43-48.

4, XinXu, XueyuWang, WenHu. Eine verbesserte Polymerase-Kreuzverbindungsspiralreaktionsassay für eine schnelle Diagnostik des Hundeparvoviruses 2 Infektion. FrontiersinVeterinaryScience.2020; 7(57):1629-1636.