Molekuläre Hybridgeräte sind die Kernausrüstung für die Nukleensäure (DNA / RNA) oder Protein-Detektion in der molekularen Biologie und werden in den Bereichen Genexpressionsanalyse, Mutationsdetektion und anderen weit verbreitet. Der Betrieb erfordert die strikte Einhaltung standardisierter Verfahren, um die Genauigkeit der Versuche zu gewährleisten. Hier finden Sie den vollständigen Gebrauchsprozess und die wichtigsten Punkte:

Vorbereitung vor dem Experiment

1. Proben- und Sondenvorbereitung

- Die Zielnukleinsäure (z. B. genomische DNA, mRNA) nach experimentellen Zwecken extrahiert und nach enzymatischer Schnittung und Elektrophoresis-Isolierung auf den festen Träger (Nylon-Membran / PVDF-Membran) übertragen wird.

- Markierungssonde: Die Reinheit und Konzentration der Sonde müssen durch Isotope (³²P), fluoreszierende Farbstoffe oder Biotin-markierte spezifische Oligonukleotidsonden überprüft werden.

2. Instrumentsprüfung

- Bestätigen Sie, dass das Hybridkontrollsystem normal ist, dass das Schaukelbett stabil funktioniert und dass die Dichtungsringe keine Alterungsbeschädigung hat.

Vorwärmung des Instruments auf die Einstelltemperatur (in der Regel 42-65 ° C, je nach Sondentyp), um die Auswirkungen von Temperaturschwankungen auf die Hybridleistung zu reduzieren.

3. Reagenzkonfiguration

- Herstellen Sie eine Vorhybridflüssigkeit (mit Lachs-DNA, SDS und anderen Schließmitteln), eine Hybridflüssigkeit und eine Waschflüssigkeit mit einer Salzkonzentration, achten Sie darauf, die Sterilisation zu vermeiden.

2. Kernbetriebsschritte

1. Vorhybridisierung

- Die Membran, die die Nukleinsäure festlegt, wird in ein Hybridrohr gelegt, mit einer ausreichenden Menge von Vorhybridflüssigkeit eingetaucht und 1-2 Stunden bei der eingestellten Temperatur inkubiert. Dieser Schritt zielt darauf ab, die nicht spezifischen Bindungsstellen auf der Membran zu schließen und den Hintergrundgeräusch zu reduzieren.

- * Schlüsselkontrolle *: Halten Sie leichte Oszilationen zur Förderung der Flüssigkeitszyrkulation und vermeiden Sie die Blasenbildung.

2. Hybridreaktionen

- Entfernen Sie die Prähybridenflüssigkeit, fügen Sie die Hybridenflüssigkeit mit der markierten Sonde direkt hinzu (die Endkonzentration der Sonde beträgt in der Regel 1-10 ng / ml) und setzen Sie die Inkubation über Nacht (8-16 Stunden) mit milder Oszillation fort.

* Optimierungsstrategie *: Hybridtemperatur = Tm-Wert -5 ℃ (Tm ist die Temperatur der Entkettung der Sonde), die Spezifizität und Empfindlichkeit berücksichtigt.

3. Waschfilm Klassifizierung

- Reinigen Sie die nicht gebundene oder falsch angepasste Sonde schrittweise mit einer Waschflüssigkeit, die die Salzkonzentration in der Reihenfolge senkt (z. B. 2 x SSC → 0,5 x SSC → 0,1 x SSC).

- * Bedienungstrick*: Die restliche Flüssigkeit wird vor jedem Wechsel abgesaugt, eine strenge Waschung verbessert die Spezifizität, aber eine übermäßige Waschung kann zu einem Verlust des wahren Signals führen.

Signalerkennung und Datenanalyse

1. Bilderfassung

- Wählen Sie die entsprechende Prüfmethode nach dem Typ der Sondenmarkierung aus: die radioaktive Selbstbildung erfordert Röntgenstrahlungen unter Druck; Chemische Luminescenz mit CCD-Bildgeräten; Die Fluoreszenzsonde kann direkt gescannt werden.

- * Belichtungskontrolle*: Die Belichtungszeit wird angepasst, um Sättigung zu vermeiden, und die synchrone Einstellung der Leerkontrolle schließt Untergrundstörungen aus.

2. Interpretation der Ergebnisse

- Quantitative Analyse mit ImageJ-Software zur Berechnung des Graustufenwertes der Streifen und zur halbquantitativen Bewertung des Niveaus der Genexpression; Die qualitative Analyse konzentriert sich auf die Konsistenz der Streifenposition mit dem erwarteten Molekulargewicht.

- * Unregelmäßige Behandlung*: Bei nicht spezifischen Streifen muss das Sondendesign neu optimiert oder die Reinigkeit des Waschens erhöht werden.

4. Nachbehandlung und Wartung

1. Abfallbeseitigung

- Isotope enthaltende Abflüssigkeiten werden nach den Spezifikationen für radioaktive Abfälle behandelt und Fluoreszenz-/Chemikalien-Leuchtmittel in spezielle Behälter zurückgewiesen.

2. Wartung der Geräte

- Entleeren Sie die Flüssigkeit im Hybridrohr, spülen Sie mit reinem Wasser und desinfizieren Sie mit 70% Ethanol und kalibrieren Sie den Temperatursensor regelmäßig.

- Aufzeichnung der Parameter dieses Experiments (Temperatur, Drehzahl, Zeit) in das Geräteprotokoll für weitere Versuche.

Der Betrieb eines Molekularhybrids erfordert eine genaue Kontrolle der Temperatur, der Zeit und der Lösungsumgebung, und jede Linkabweichung kann zu falsch positiven / falsch negativen Ergebnissen führen. Es wird den ersten Benutzern empfohlen, parallele kontrollierte Experimente durchzuführen und die optimalen Hybridbedingungen durch Vorexperimente zu bestimmen. Der standardisierte Betrieb wird mit strengen Qualitätskontrollen verbunden, um die Zuverlässigkeit der Experimentergebnisse zu gewährleisten.