Zusammenfassung

Neugeborene Mäuse bieten eine Technologie zur lebendigen Elektrokonversion der Netzhaut ein entscheidendes Instrument für die Entwicklung der Netzhaut und die Erkrankungsforschung. Mit dem Venetian Gene Pulser 830 Quadratwellen-Elektroperforator werden die Parameter der Elektrokonversion optimiert, um eine effiziente Lieferung und Expression von exogenen Genen in der Netzhaut von Neugeborenen Mäusen zu erreichen, um die Transfektionseffizienz erheblich zu verbessern und eine zuverlässige technologische Plattform für die Grundlagenforschung und die Transformationsmedizin im Zusammenhang mit der Netzhaut zu bieten.

Einleitung

Die Forschung der Netzhaut als Schlüsselgewebe für die Übertragung von visuellen Signalen, deren Entwicklungsmechanismen und Mechanismen der Entstehung von Krankheiten ist seit jeher ein Hotspot im Bereich der Augenmedizin. Neugeborene Mäuse befinden sich in einer schnellen Entwicklungsphase, in der genetische Manipulationen die Rolle von Genen bei der Differenzierung, Migration und Funktionsbildung der Nettenzellen effektiv untersuchen können. Allerdings haben die herkömmlichen Genübertragungsmethoden Probleme wie geringe Effizienz und große Zellschäden bei der Operation der lebenden Netzhaut, die es schwierig sind, die Anforderungen der genauen wissenschaftlichen Forschung zu erfüllen.

Die Elektrotransformationstechnik ändert die Durchlässigkeit der Zellmembran sofort durch ein pulsiertes elektrisches Feld, so dass Makromoleküle wie exone Nukleensäuren in die Zelle gelangen und einen Vorteil bei der Genentwicklung in lebendem Gewebe zeigen. Mit seiner fortschrittlichen Quadratwellenpulstechnologie, seinem intelligenten Überwachungssystem und seiner flexiblen Parametereinstellung bietet das Venetian Gene Pulser 830 eine effiziente und präzise Lösung für die bioelektrische Transformation der Netzhaut von Neugeborenen Mäusen und hilft Forschern dabei, die Engpässe herkömmlicher Technologien zu überwinden.

Materialien und Methoden

1. Versuchstiere

Neugeborene C57BL/6J Mäuse 0-2 Tage nach der Geburt (P0-P2) wurden von diesem Labor SPF-Klasse Tierkammer zur Verfügung gestellt, mit einer Umgebungstemperatur (22 ± 2) °C, Luftfeuchtigkeit 50% -60%, 12 Stunden Licht / Dunkel Zyklus.

2. Hauptreagenzien

Plasmid-DNA (mit dem Zielgen GFP, erstellt in diesem Labor), ein Reagenz (zur Herstellung von Elektro-Transformationspuffern mit NaCl, KCl, Glukose und anderen Komponenten, pH-Wert auf 7,4 eingestellt), Anästhesium (Isofluoran, zur Anästhesie von Mäusen), Desinfektionsmittel (75% Ethanol).

3. Hauptinstrumente

Venetian Gene Pulser 830 Quadratwellen-Elektroperforator, Teleskopmikroskop (eine Marke für die Beobachtung chirurgischer Operationen), Mikroinjektionsnadel (Außendurchmesser 10-15 μm für Plasmidinjektionen), thermostatische Heizplatte (zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei Mäusen).

Experimentelle Schritte

1. Mäuse Anästhesie und Fixierung

Neugeborene Mäuse wurden in eine Anästhesie-Box mit Isofluoran platziert und nach der Anästhesie auf eine thermostatische Heizplatte übertragen, um die Körpertemperatur stabil zu halten. Verwenden Sie Klebeband, um den Kopf und die Gliedmaßen der Maus vorsichtig zu befestigen, um sicherzustellen, dass die Maus während der Operation stabil ist.

2. Nettenpositionierung und Plasmidinjektion

Unter dem physiologischen Mikroskop wird die Plasmid-DNA des Gens (in einer Konzentration von 1-2 μg / μL) mit einer Spurenprobe abgezogen, die Nadel vom Rand der temporalen lateralen Hornhaut des Augenkugels der Maus eingebracht, die Nadelspitze langsam in die Glashöhle eingebracht, das Kristallkörper vermieden und 5-10 μL Plasmidlösung genau in die Unterhöhle der Netzhaut injiziert. Achten Sie während der Injektion darauf, die Tiefe und die Geschwindigkeit der Injektion zu kontrollieren, um Schäden am Netzwerkgewebe zu vermeiden.

3. Einstellung und Betrieb der Elektroperforationsparameter

Das VENIDE Gene Pulser 830 Quadratwellen-Elektroperforator verfügt über ein vorprogrammiertes Optimierungssystem zur Auswahl eines Säugetier-Zelltransfektionsmodus für die Eigenschaften des Netzhaut-Gewebes von Neugeborenen Mäusen und ruft die empfohlenen Parameter der eingebauten Netzhaut-Zellen auf: Quadratwellenpulse, Spannung, die je nach Alter der Maus und Augengröße angepasst wird (in der Regel 50-80V), Impulsdauer von 10-20ms, 3-5 Impulse, Impulsintervalle von 1-2s.

Halten Sie die maßgeschneiderte Pinzettelektrode (Elektrodenabstand 1-2 mm, die Oberfläche ist isoliert, um Stromleckage zu vermeiden) vorsichtig auf das Auge der Maus fest, um sicherzustellen, dass die Elektrode eng an die Augenoberfläche passt und das Auge nicht unterdrückt. Durch den Start des Elektro-Piercing-Programms durch den Fußschalter zeigt der 10-Zoll-Touchscreen des Instruments die Dynamik der Pulswellen und der Parameter in Echtzeit an und ermöglicht es dem Experimentierenden, den gesamten Prozess zu überwachen. Während der Elektroperforation führt das Instrument automatisch eine intelligente Impedanzprüfung durch, misst den Probenwiderstand vor dem Impuls und passt die Parameter dynamisch an, um sicherzustellen, dass die Bedingungen jedes Elektroschocks mit dem Zustand der Netzhaut-Zellen übereinstimmen. Gleichzeitig hat die Bogenschutz- und Polarwechseltechnik Bogenschäden beendet, die Ladungsbarriere der Zellmembran durchbrochen und die Erfolgsquote schwieriger Zellen verbessert.

4. Nachbehandlung

Nachdem die elektrische Drehung abgeschlossen ist, bewegen Sie die Maus zurück zur Mutter und halten Sie die Umgebung warm und ruhig. Der Augenzustand und das Überleben der Mäuse werden täglich nach der Operation beobachtet, um sicherzustellen, dass keine Infektionen und andere Komplikationen auftreten.

Ergebnisse und Diskussionen

Effizienzprüfung

Nach 3 Tagen der Elektrospin nehmen Sie die Augen der Maus, bereiten Sie die gefrorenen Scheiben der Netzhaut vor und beobachten Sie die Expression des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) durch das Fluoreszenzmikroskop. Die Ergebnisse zeigten, dass ein offensichtliches GFP-Fluoreszenzsignal in allen Zellschichten der Netzhaut sichtbar war, insbesondere in der Gangliozellschicht, der Kernel- und der Externkernelschicht, die Transfektionseffizienz um mehr als 40% im Vergleich zu herkömmlichen Methoden verbessert wurde (basierend auf internen Daten von Venedig). Dank der hohen Intensität der elektrischen Felder des Venetian Gene Pulser 830 Quadratwellen-Elektroperforators wird die Durchlässigkeit der Zellmembran sofort neu gestaltet und eine effiziente Lieferung von Nukleinsäure-Makromolekülen ermöglicht.

Bewertung des Zellallebens und der Gewebeschäden

Bei der Beobachtung der Netzhaut-Gewebestruktur durch Sumicin-Irrigation (HE) Färbung waren die Schichten der Netzhaut von elektrotransformierten Mäusen klar, die Zellen waren ordentlich angeordnet und keine offensichtlichen Zellnakdote oder entzündlichen Reaktionen im Vergleich zur Kontrollgruppe auftreten. Das Experiment zeigte, dass die Überlebensrate der Nettenzellen nach der Elektrokonversion über 90% betrug, was darauf hindeutet, dass die Elektrokonversionstechnologie geringe Schäden am Netzwerkgewebe verursacht hat, was die Machbarkeit von nachfolgenden Experimenten gewährleistet.

Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Technologien

Die herkömmlichen Methoden zur Transfektion von Viruslagern haben Probleme wie lange Vorbereitungszyklen, hohe Kosten und begrenzte Trägerkapazität und können eine Immunantwort auslösen. Die Bioelektrokonversionstechnologie, vermittelt durch den Quadratwellenelektrophorer Gene Pulser 830 von Venedig, erfordert keine Virenverpackung und liefert direkt große Moleküle wie DNA, RNA und Proteine, was einfache, schnelle und kostengünstige Bedienung ermöglicht und gleichzeitig die potenziellen Risiken von Virenträgern vermeidet. Das intelligente Überwachungssystem in voller Wellenform sorgt dafür, dass der Experimentsprozess transparent und kontrollierbar ist, dass die Daten zurückverfolgbar sind und eine präzise Reproduktion der Forschungsergebnisse ermöglicht. Das vorprogrammierte Optimierungssystem verfügt über eine integrierte Bibliothek an gängigen Zellstammparametern mit einem Klick und unterstützt gleichzeitig benutzerdefinierte Pulsparameter, die sich an komplexe Szenarien wie die Netzhaut von Neugeborenen Mäusen anpassen und eine hohe Flexibilität und Anwendbarkeit zeigen.

Technische Optimierung und Vorsichtspunkte

Im Laufe des Experiments wurde festgestellt, dass die Optimierung der Elektroperforationsparameter ein Schlüsselfaktor ist, der die Transfektionseffizienz beeinflusst. Zu hohe Spannungen oder zu viele Impulse können zu Zellschäden führen, während eine zu niedrige Spannung eine unzureichende Transfektionseffizienz verursacht. Die intelligente Impedanzerkennung des Gene Pulser 830 von Venedig behebt dieses Problem effektiv, indem die Parameter dynamisch an den Probenwiderstand angepasst werden. Darüber hinaus können die Konzentration und das Volumen des injizierten Plasmids, die Anpassung der Elektroden und das Tagesalter der Mäuse Auswirkungen auf die Ergebnisse haben und die Bedingungen streng kontrolliert werden müssen.

Anwendungsaussichten

Grundlagenforschung

Diese Technik kann weit verbreitet in der Funktionsforschung von Genen, die mit der Entwicklung der Netzhaut zusammenhängen, wie die CRISPR-Genbearbeitungstechnologie in Kombination mit der Elektrotransformation verwendet werden, um die Knocking oder Knocking von Netzhaut-spezifischen Genen zu erreichen, um ihre Rolle bei der Differenzierung von Netzhaut-Zellen und der Bildung von Neurosyklen zu untersuchen; Die siRNA-Lieferung kann verwendet werden, um die Zielgenexpression zu hemmen und die Mechanismen der Gene bei der Entstehung von Netzhaut-Erkrankungen zu erforschen; In der Reprogrammierungsforschung von Stammzellen kann die Elektrokonversionstechnologie reprogrammierte Faktoren effizient in die Netzhaut-Stammzellen importieren und neue Wege für die Forschung in der regenerativen Medizin der Netzhaut bieten.

Transformation im medizinischen Bereich

In Bezug auf die Elektrotransformation von lebenden Tumoren kann eine präzise gezielte Behandlung durch die Elektrotransformation von therapeutischen Genen oder Medikamenten gegen Augentumoren wie Retinoblastoma erreicht werden; Bei der Entwicklung von Impfstoffen kann die Elektrokonversionstechnologie Antigene an die Netzhaut-bezogenen Immunzellen liefern, Immunreaktionen induzieren und neue Ideen für die Augenpfstoffforschung liefern; In vitro Gentherapie, für genetische Retinenerkrankungen wie pigmentose Retinitis, angeborene Negrosie und andere, kann die Elektrokonversionstechnologie normale Gene in die Netzhaut Zellen importieren, die Grundlage für die klinische Anwendung der Gentherapie zu legen.

Landwirtschaft und Industrie

Während sich die Forschung auf die Netzhaut von Neugeborenen Mäusen konzentriert, bietet die breite Anwendung des Quadratwellen-Elektroperforators Gene Pulser 830 auch in der Landwirtschaft und Industrie ein großes Potenzial. In der genetischen Verbesserung von Pflanzen kann die Gene-Übertragung von Pflanzenprotonomen verwendet werden, um die Verbesserung der Pflanzensorten zu beschleunigen; In der Hefe-Engineering-Bakterien-Konstruktion und der mikrobiellen Stoffwechseltechnik kann die Elektrokonversionstechnologie die Einführung von exotischen Genen effizient erreichen und die Produktivität der Engineering-Bakterien verbessern.

Mit seiner innovativen Quadratwellenpulstechnologie, seinem intelligenten Überwachungssystem und seiner umfassenden technischen Unterstützung ist das Gene Pulser 830 Quadratwellen-Elektroperforator von Venedig die zuverlässige Wahl von über 500 führenden Forschungseinrichtungen. Ob präzise Genmanipulation in der Grundlagenforschung oder innovative Therapieforschung in der Transformationsmedizin, das Gerät bietet Forschern eine effiziente und zuverlässige Technologieplattform. Derzeit bietet VENIDE kostenlose Beratung und Produktversuche an, um Wissenschaftlern zu helfen, die Hindernisse der Transfektionstechnologie zu überwinden und die Forschung in den Lebenswissenschaften und verwandten Bereichen zu fördern.

Referenzen

1. Sauerstoff-induzierte Veränderungen in der angiogenesischen und Sauerstoffstress-bezogenen Genexpression bei neonatalen Retinopathien in Mäusen [J] . Yu Zhengyang , Gong Chen Yuan , Zhang Guoqing . Chinesische Pharmakologie. 2014, Nr. 010

2. Expression von Mononukleocytochemoprotein-1 in einem sauerstoff-induzierten neonatalen Mausmodell der Retinopathie [J] . Dong Ning ,Guoli-Gruppe ,Shaoling . Chinese Experimental Eye Journal. 2012, Nr. 004

3. Expression von Mononukleocytochemoprotein-1 in einem sauerstoff-induzierten neonatalen Mäusenmodell von Retinopathie [J] . Dong Nin ,Gueli-Gruppe ,Shaoling . Chinese Experimental Eye Journal. 2012, Nr. 004

4. Veränderungen und Bedeutung der Expression von MCP-1 in Neugeborenen Mäusen Netzhaut Gewebe [J] . Dong Ning , Jili Group , Shaoling . Shandong Medizin. 2011, Nr. 026

5. Expression von MMP-2 in einem neonatalen Mausmodell mit vorzeitiger Retinopathie [J] . Ginger Shuang, Chen Xiaolong . Zeitung der Liaoning Medical School. 2009, Nr. 006