Pathogene bakterielle Infektionen stellen eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, insbesondere bei chronischen und akuten Wunden, bei denen die Ansiedlung von Bakterien und die Bildung von Biofilms die Wundheilung erschweren. Die Therapie auf der Basis von aktivem Sauerstoff (ROS) hat die Vorteile eines breiten Spektrums an antibakterieller Aktivität und niedriger Resistenz und hat sich jetzt zu einer nicht-antibiotischen Strategie zur Behandlung von Infektionen entwickelt. Die klinische Anwendung ist jedoch durch Probleme wie eine geringe Dosierungseffizienz, schlechte Bakterien-Targeting und Entzündungen nach der Behandlung begrenzt.

Zu diesem Zweck hat das Team von Prof. Liwei an der Pharmazeutischen Fakultät der Universität Wuhan einen multifunktionalen Doppelschicht-Mikronadelplacer (LFT / S-MN) entwickelt, der effektiv sterilisiert und die Wundheilung fördert. Der Patch bindet positiv geladene Lactoferritin-Kino-Nanopartikel (LFT NPs) mit Porphyrin-Sonosensitiven (TAPPFe) und legt sie in eine lösliche Substratschicht, während das entzündungshemmende Medikament Spermidin (SPD) in eine pH-reagierende Nadelschicht geladen wird. Wenn die Mikronadel in das infizierte Gewebe eingesetzt wird, können die freigegebenen LFT-NPs negativ geladene Bakterien effektiv zielen und sammeln, um eine große Menge an ROS durch eine synergistische chemodynamische und sonodynamische Therapie (CDT / SDT) unter Ultraschallstimulus zu erzeugen. Gleichzeitig löst die saure Mikroumgebung der Wunde den schrittweisen Abbau der Nadelspitze aus, wodurch die kontrollierte Freisetzung von SPD und die Immunregulation erreicht werden. In einem Maus-Wundenmodell, das mit P. aeruginosa infiziert war, reduzierte der LFT/S-MN-Patch die Bakterienbelastung signifikant, unterdrückte die Entzündungsreaktion, förderte die Kollagen-Ablagerung und die neogenese Gefäßbildung und beschleunigte das Schließen der Wunde.

Diese Arbeit schlägt eine vielversprechende nicht-antibiotische Strategie vor, die die Wunden durch eine synergistische CDT / SDT und Entzündungsregulation antibakteriell und Geweberegeneration erreicht. Der Mikro-Nadel-Patch wird mit der Micro-Stereolithographie (PμSL) Technologie (microArch) verwendet. ® S240， Präzision: 10 μm) Die 3D-Druckmaschine wurde nach einer PDMS-Umformung vorbereitet, und die Ergebnisse wurden in der Zeitschrift "Journal of Controlled Release" mit dem Titel "Three-in-one bilayer microneedle patch for ultrasound-activated antibacterial therapy and immune modulation in wound healing" veröffentlicht. Ginger Peng ist der Autor der Dissertation an der Fakultät für Pharmazie der Universität von Wuhan, Professor Liwei ist der Autor der Dissertation, die Fakultät für Pharmazie der Universität von Wuhan ist die Abschlusseinheit der Dissertation, und die oben genannten Forschungsarbeiten werden durch das Projekt des Nationalen Naturwissenschaftlichen Fonds und die Finanzierung des PI-Zentrums für Biomedizin von Tacon der Universität von Wuhan unterstützt.

Wie in Abbildung 1 gezeigt, integriert der Patch positiv geladene Lactferritin-Nanopartikel (LFT NP), die mit Porphyrin Sound Sensitive (TAPPFe) gekoppelt sind, sowie eine pH-Reaktionsspitze, die das entzündungshemmende Arinamin (SPD) belastet. Nachdem das infizierte Gewebe eingesetzt wurde, zielte das freigegebene LFT NP effektiv auf und sammelte Bakterien mit negativer Ladung, wodurch eine starke ROS durch synergistische Chemodynamik- und Sonodynamiktherapie (CDT / SDT) unter Ultraschallstimulation erzeugt wird. Gleichzeitig löst die Mikroumgebung der sauren Wunde den allmählichen Abbau der Spitzenschicht aus, die kontrollierte Freisetzung von SPD zur Immunmodulation. In einem Maus-Wundenmodell mit Kupfergrün-Fake-Monocyte-Infektion verringerte der LFT/S-MN-Patch die Bakterienbelastung signifikant, unterdrückte Entzündungen, förderte Kollagen-Ablagerung und neogenese Gefäßbildung und beschleunigte das Schließen der Wunde.

Abbildung 1. Darstellung der Struktur und des Therapiemechanismus der Behandlung von infizierten Wunden durch LFT/S-MN-Patches. (A) Die Konstruktion und Herstellung von doppelschichtigen LFT/S-MN-Patches besteht aus einer löslichen Basis-Unterlage, die positiv geladene LFT NPs belastet, und einer pH-Reaktionsspitze, die SPDs verpackt. (B) Nach dem Einfügen der Infektionsstruktur löst sich die Substrat schnell auf und setzt LFT NPs frei, LFT NPs zielen aktiv auf Bakterien mit negativer Ladung und erzielen eine effektive Bakterienentfernung durch Synergie zwischen SDT und CDT, um ROS unter den USA zu erzeugen. Gleichzeitig löst die Mikroumgebung der sauren Wunde den Spitzenabbau aus, was zu einer kontinuierlichen Freisetzung von SPD führt, die zur Entzündungsregulation verwendet wird. Diese gemeinsame Strategie fördert die Entfernung von Bakterien, die Immunregulation und die Geweberegeneration und beschleunigt letztlich die Wundheilung.

Um die Standortspezifizität zu erreichen und die Drogenfreisetzung zu kontrollieren, wurden mit einer sequenziellen Formstrategie pH-reagierende Doppelschicht-MN-Patches, bekannt als LFT/S-MN-Patches, vorbereitet. Zur Visualisierung und Strukturprüfung wurden zwei Fluoreszenzsonde, Rodamin B-markiert mit Rinderserum-Albin (RhB-BSA) und Isocyanofluorescentin (FITC), jeweils auf die Spitze und Basisschicht der Nanopartikel geladen (Abbildung 2A und B). Die Spitzenschicht wird durch UV-induzierte freie Radikale Polymerisation und die Schiff-Alkali-Kreuzung zwischen Methylacrylat Shell Polysaccharide (CSMA) und SPDTA synthetisiert, wobei die Basisschicht aus 18 Gew.-% Polyethylanol (PVA) und Saccharoselösung und die Trägerschicht aus 20 Gew.-% Polystyren (PS) besteht. Die Analyse der Energy Dispersion X-ray Energy Spectrometry (EDS) (Abbildung 2C) zeigt, dass die Eisenelemente aus LFT NPs gleichmäßig verteilt sind und sich auf die Grundschicht beschränken, während die Kohlenstoff-Elemente auf den Spitzen gleichmäßig verteilt sind, was eine offensichtliche räumliche Trennung anzeigt. Der erhaltene LFT/S-MN-Patch besteht aus einem 10 × 10 MN-Array mit einer Spanne von etwa 0,5 cm2 (Abbildung 2D). Jede Nadel hat eine eindeutige konische Form mit einer Höhe von etwa 850 μm und eine offensichtliche Doppelschichtstruktur (Abbildungen 2E und F). Mechanische Tests zeigten, dass die Bruchkraft pro Nadel etwa 4N (Abbildung 2G) ausreicht, um eine effektive transdermale Insertion und eine potenzielle klinische Anwendung zu ermöglichen.

Abbildung 2: Charakterisierung des LFT/S-MN-Patches. Repräsentative Lichtfeld- und fluoreszierende Bilder von (A-B) LFT/S-MN-Patches, die die strukturelle Integrität und die fluoreszierende Markierung der eingebetteten Komponenten veranschaulichen. (C) Energiespektrogramm bestätigt die Verteilung der Elemente innerhalb der MNs. (D) Optische Bilder und (E, F) SEM-Bilder zeigen die Form von LFT / S-MNs. Gelbe gestrichelte Linien stellen die Schnittstelle zwischen der ph-Reaktionsspitze und der löslichen Substrate dar. (G) Die Kraft-Verschiebungskurve von LFT/S-MNs zeigt, dass ihre mechanische Festigkeit für die Durchdringung der Haut geeignet ist.

Die Hautdurchdringbarkeit von LFT/S-MN-Patches wird mit isolierter Schweinehaut bewertet. Nach der Anwendung, MNs erfolgreich durchbrechen die keratin und transportieren die verpackten fluoreszierenden Farbstoffe in die Haut, fluoreszierende Bildgebung zeigt (Abbildung 3A), histologische Querschnitt bestätigt (Abbildung 3B). Beobachten Sie das gelöste Verhalten und die anschließende Freisetzung von LFT NPs durch Fluoreszenzmikroskop. Wie in Abbildung 3C gezeigt, löste sich die Substrat in PBS (pH 7,4) innerhalb von 80 Sekunden und förderte die schnelle Freisetzung von LFT NPs aus der MN-Substrat. Angesichts der Tatsache, dass die Mikroumgebung der infizierten Wunde in der Regel sauer ist, untersuchten die Autoren das pH-Reaktionsverhalten der MN-Spitze weiter. In vitro-Freisetzungsstudien zeigten, dass die Spitze unter leichten sauren Bedingungen (pH 5,6) allmählich abbaut und am 15. Tag fast abbaut, während eine minimale Abbau unter neutralen Bedingungen (pH 7,4) auftritt (Abbildung 3D), was auf das säureempfindliche Verhalten der Spitze hindeutet. Quantitative Messung der Effizienz der Medikamentladung und -lieferung (Abbildungen 3E und F). Der LFT beträgt 145,43 ± 2,76 μg und der SPD 14,96 ± 0,08 μg. Nach der Hautverabreichung betrug die Dosierung von LFT über MNS 132,83 ± 2,91 μg und die Dosierung von SPD über MNS 14,38 ± 0,22 μg, wobei die Wirksamkeit beider Medikamente über 90% lag. Darüber hinaus erreichte die kumulative Freisetzung von SPD unter sauren Bedingungen (pH 5,6) am 15. Tag 88,87 ± 3,58%, was deutlich höher als PBS (pH 7,4) war, was das Säurereaktionsfreisetzungsspektrum der MN-Spitze weiter bestätigte (Abbildung 3G).

Abbildung 3. Beurteilung der Drogenfreisetzung von LFT/S-MN-Patches. (A) Repräsentative Lichtfeld- und Fluoreszenzmikroskopbilder von LFT/S-MN-Patches nach der Implantation von isolierter Schweinehaut. (B) Histologische Schnitte der Schweinehaut nach der MN-Patch-Implantation. (C) Optische Bilder zeigen die schnelle Auflösung und Trennung der Spitzenschicht in der PBS-Basis innerhalb von 80 Sekunden. (D) Umkehrte Fluoreszenzmikroskopbilder wurden unter verschiedenen pH-Bedingungen (pH 7,4 und 5,6) angezeigt und simulierten eine neutrale und leicht saure Wundenumgebung, in der MN innerhalb von 15 Tagen abgebaut wurde. (E) Quantifizierung der LFT/S-MN-Patch LFT-Ladung und -Lieferung. (F) Quantifizierung der LFT/S-MN Patch SPD-Ladung und -Lieferung. (G) In vitro kumulative Freisetzungskurve von SPD im Laufe der Zeit in LFT/S-MNs. Die Daten sind in Mittelwert ± SD dargestellt (n = 3 unabhängige Stichproben).

Die Autoren bewerteten systematisch die in vitro antibakterielle Wirkung von LFT/S-MN-Patches. Wie in Abbildung 4D gezeigt, beträgt die minimale Inhibitionskonzentration (MIC) von LFT bei Ultraschallbestrahlung (3 MHz, 0,97 W/cm2, 50% Leerverhältnis, 30 min) 128 μg/ml. Einzelne LFT/S-MN-Patches zeigten eine moderate antibakterielle Aktivität mit einer Inhibition von 36,41 ± 0,75% gegen Staphylococcus aureus und einer Inhibition von 35,87 ± 1,48% gegen Copper Green Pseudosytes (Abbildungen 4A und E). Im Gegensatz dazu erhöhte sich nach der Ultraschallaktivierung die bakteriosuppressive Rate des LFT/S-MN-Patches mit 99,95 ± 0,04% bzw. 99,96 ± 0,04% (Abbildung 4E), was darauf hindeutet, dass Bakterien fast inaktiviert sind. Die SYTO 9/PI-Färbung bestätigte diese Ergebnisse weiter, wobei die LFT/S-MN US-Gruppe eine primäre rote Fluoreszenz zeigte, die auf einen breiten Bakterientod hindeutete (Abbildungen 4B und F). Scanelektroskope (SEM) liefern zusätzliche morfologische Beweise; Bakterien aus der unbehandelten Gruppe behielten die Membran intakt und glatt, während Bakterien, die mit Ultraschall aktivierten LFT/S-MN ausgesetzt waren, deutliche strukturelle Schäden und Membranbruche zeigten (Abbildung 4C). Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse, dass nach der Ultraschallaktivierung LFT / S-MN-Patches eine große Menge an lokalem ROS erzeugen können, um Bakterien an der Stelle der Verletzung effektiv zu eliminieren.

Abbildung 4. Studie der antibakteriellen Eigenschaften von LFT/S-MN-Patches in vitro. (A) Repräsentative Fotos von Agalplatten, die die antibakteriellen Wirkungen von LFT / S-MNs auf Staphylococcus goldium und Copper-Green Fake Monocytes zeigen. (B) Fluoreszenzmikroskopbilder zeigen, dass Staphylococcus goldium und Copper-green Pseudomons oxidativen Stress durch ROS unter verschiedenen Behandlungsbedingungen erzeugen. (C) ein SEM-Bild der bakteriellen Morphologie nach der Behandlung, die die Membranbeschädigung und strukturelle Veränderung von Staphylococcus aureus und Copper-Green False Monocytes zeigt. (D) Die minimale Inhibitionskonzentration (MIC) von LFT in LFT/S-MNs gegen Staphylococcus aureus zeigt eine dosisabhängige antibakterielle Aktivität. Der rote Pfeil zeigt den MIC-Wert von LFT an. (E) Quantitative Analyse der bakteriellen Vitalität verschiedener nach der Behandlung durch die Beurteilung der lebenden / toten Färbung. (F) Die entsprechenden Messungen der grünen Fluoreszenz-Intensität (FI) in lebenden / toten Experimenten bestätigen die antibakterielle Wirkung weiter. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt (n = 3 unabhängige Proben). ** p < 0.01，** p < 0.001，**** p < 0.0001。 NS bedeutet keine Bedeutung.

Um die in vivo therapeutische Wirkung von LFT / S-MN-Patches zu überprüfen, verwendeten die Autoren Kupfergrün-Fake-Monozyten (von P. aeruginosaErstellen Sie ein Modell der invasiven Infektion der Maus Haut (Abbildung 5A). Die infizierten Mäuse wurden zufällig in acht Gruppen unterteilt (jede Gruppe n = 5), einschließlich der nicht-Ultraschallgruppen (Blank, S-MN, LF / S-MN, LFT / S-MN) und der Ultraschallbehandlungsgruppen (Blank + US, S-MN + US, LF / S-MN + US, LFT / S-MN + US). Das Ultraschallprogramm umfasst tägliche Beleuchtung von 3 MHz, 0,97 W/cm2, 50% Leerbehalt, 30 Minuten, 3 Tage in Folge. Der Fortschritt der Wunde wurde am Tag 0, 1, 3, 5 und 9 nach der Behandlung durch Fotografie überwacht (Abbildung 5B). Am ersten Tag verringerte sich die purulente Infiltration in der LFT/S-MN+US-Gruppe deutlich, was die kombinierte antibakterielle Wirkung von CDT und SDT widerspiegelt. Im Gegensatz dazu zeigten die nicht-Ultraschallgruppen eine breitere Sepsis und Entzündung. Am 3. Tag, nachdem die Ultraschallverabreichung abgeschlossen ist, sammelt man Wundenbettproben für eine Bakterienkultur, um die verbleibende Bakterienbelastung zu bewerten (Abbildung 5E). Die Tablettenzahl zeigte, dass die LFT/S-MN+US-Kolonien am wenigsten gebildet wurden, was darauf hindeutet, dass sie eine stärkere antibakterielle Aktivität im Körper haben (Abbildung 5F). Am 9. Tag hatten LFT/S-MN+US behandelte Mäuse eine hohe Wundheilungsrate und eine deutliche Geweberegeneration (Abbildung 5C). Während der gesamten Behandlung zeigte die Gewichtsüberwachung keine deutlichen Schwankungen zwischen den Gruppen (Abbildung 5D), was darauf hindeutete, dass der MN-Patch eine gute körperliche Biokompatibilität hatte. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass LFT / S-MN in Verbindung mit Ultraschall wirksam bakterielle Infektionen beseitigen und die Wundheilung im Körper erheblich beschleunigen kann.

Abbildung 5. Antimikrobielle Wirkung und Wundheilungseigenschaften von LFT/S-MN-Patches im Körper. (A) Schema eines Maus-Wundenmodells mit Kupfergrün-Fake-Monozyten-Infektion und Behandlungsstrategien mit MN-Patches plus oder ohne US-Stimulation. (B) Repräsentative Fotos der Wundenstellen am Tag 0, 1, 3, 5 und 9 nach der Behandlung. Die schwarze Spule zeigt die ursprüngliche Wundengrenze. (C) Quantitative Analyse der Wundheilung im Laufe der Zeit in den einzelnen Behandlungsgruppen (n = 5). (D) Überwachung des Körpergewichts der Mäuse während der Behandlung (n = 5). (E) Fotos von Agalplatten von den Bakterienkolonien der Wundenbett der jeweiligen Gruppen am 3. Tag kultiviert. (F) Biodynamisierung der Bakterien basierend auf der Analyse der Kolonienbildungseinheiten (CFU) (n = 3). Die Daten werden in Mittelwert ± SD angegeben. *** p < 0.001，**** p < 0.0001。 NS bedeutet keine Bedeutung.

Schlussfolgerung:Diese Studie entwickelte erfolgreich einen doppelschichtigen Mikronadel-Patch (LFT / S-MN) mit pH-Reaktion, der eine effiziente Behandlung von infizierten Wunden durch die Integration der ultraschallaktivierten synergistischen antibakteriellen Therapie (CDT / SDT) mit der Immunmodulation durch saure Mikroumgebung auslöst. Der Patch kann nicht nur LFT NPs, die auf Bakterien gerichtet sind, schnell freisetzen und eine große Menge an ROS unter Ultraschall erzeugen, um Bakterien und Biomembrane zu entfernen, sondern auch SPD unter sauren Bedingungen der Wunde kontinuierlich freisetzen, die Makrophagenpolarisierung regulieren und übermäßige Entzündungen unterdrücken. In vitro-Experimente haben bestätigt, dass diese Strategie das Schließen der Wunden erheblich beschleunigt, die Geweberegeneration fördert und eine ausgezeichnete biologische Sicherheit bietet. Diese Arbeit bietet eine neue Strategie für die Behandlung von nicht antibiotikabhängigen infektiösen Wunden und die Geweberegeneration mit klinischem Transformationspotenzial.