Die Fluoreszenz-Quantitative-PCR (qPCR) ist eine Kernausrüstung in den Bereichen der molekularen Biologie, der klinischen Diagnose (wie der Coronavirus-Test) und anderen, deren Genauigkeit die Zuverlässigkeit der Experimentergebnisse direkt beeinflusst. Die Korrektur (Kalibrierung) ist ein entscheidender Schritt, um die Leistungsstabilität des qPCR-Geräts zu gewährleisten, und erfordert regelmäßige systematische Überprüfung und Anpassung des Temperaturregelsystems (Genauigkeit der Temperaturregelung) und des optischen Systems (Detektion von Fluoreszenzsignalen).

Kernziele der Korrektur

Die Korrektur des qPCR-Messgerätes soll sicherstellen, dass die folgenden Schlüssellanzeige den Anforderungen entsprechen:

Temperaturkontrollsystem: Temperaturanzeigefehler (Abweichung der Einstelltemperatur von der tatsächlichen Temperatur), Temperaturgleichmäßigkeit (Temperaturunterschied zwischen den Reaktionsbohren), Temperaturschwankungen (Veränderungen der Temperatur im Laufe der Zeit), maximale Temperaturüberlastung (Umfang, der den Einstellten Wert während des Erwärmens / Kühlprozesses übersteigt), durchschnittliche Erhöhungs- und Kühlgeschwindigkeit (Geschwindigkeit des Erwärmens / Kühlprozesses).

Optische Systeme: Präzision der Fluoreszenz-Intensität (Konsistenz des gleichen Lochs Fluoreszenzsignals), Präzision der Schwellenzykluszahl (Ct-Wert) (Konsistenz der verschiedenen Loch-Ct-Werte), Drift der Schmelztemperatur (Tm-Wert) (Temperaturabweichung, wenn die Fluoreszenz-Intensität um die Hälfte sinkt), Fluoreszenz-linearer Korrelationskoeffizient (lineares Verhältnis zwischen der Fluoreszenz-Intensität und der Nukleinsäurekonzentration).

Vorbereitungen vor der Korrektur

1. Umweltbedingungen

Temperatur: 15-30 ° C (Vermeidung von Temperaturschwankungen, die die Kalibrierungsergebnisse beeinflussen);

Relative Luftfeuchtigkeit: 20-85% RH (verhindert Feuchtigkeit des Instruments);

Stromversorgung: Stabilisieren Sie die Spannung (UPS wird empfohlen), um Stromausfälle zu vermeiden, die den Kalibrierungsprozess beeinträchtigen.

2. Ausrüstung und Materialien

Standardsubstanzen: Die Verwendung von zertifizierten Standardsubstanzen (z. B. Plasmid-DNA, Ribonusäure-Standardsubstanzen), deren Eigenschaftswerte (Kopienzahl ≥ 106 Kopien / μL) und die relative Ausdehnungsunsicherheit (≤ 5%) müssen den Anforderungen von JJF (JIN) 04-2020 entsprechen;

Kalibrierungsausrüstung: optischer Simulator (integrierter Temperatursensor mit emittierendem Lichtgenerator, Temperaturmessbereich 0-120 ° C, maximaler zulässiger Fehler ± 0,1 ° C; emittierende Lichtwellenlänge 360-780 nm, einstellbare relative Lichtstrahlungsintensität), Mehrkanal-Temperaturprüfer (z. B. JDPC-96, zur Messung der Temperaturdifferenz zwischen Reaktionsbohren);

Verbrauchsmaterialien: Spezielle Kalibrierplatten (z. B. AB7500 ROI-Kalibrierplatte, Hintergrundkalibrierplatte), Pipetten (2 μL, 10 μL usw., die Dosierprüfung erfordert), pulverfreie Handschuhe (Kalibrierplatte zur Verhinderung von Verschmutzung).

Hauptprozess der Korrektur

Der Korrekturprozess des qPCR-Geräts muss den JJF (津) 04-2020 "Echtzeit-Fluoreszenz-Quantitative-PCR-Gerät-Kalibrierungsspezifikation" strikt entsprechen, hauptsächlich umfasst die Kalibrierung des Temperatursystems und die Kalibrierung des optischen Systems.

Kalibrierung des Temperatursystems

Die Temperatur ist der Kernparameter der qPCR-Reaktion und beeinflusst direkt die Effizienz der DNA-Amplifikation. Die Kalibrierung von Temperatursystemen erfordert die Verwendung eines optischen Simulators (anstelle von Reaktionsrohren), um die Temperaturänderungen in der tatsächlichen Reaktion zu simulieren und die Temperaturregelleistung des Instruments zu überprüfen.

Vorbereitung vor der Kalibrierung

Verbinden Sie den optischen Simulator mit dem qPCR-Gerät, um sicherzustellen, dass der untere Temperatursensor und die obere fluoreszierende emittierende Lichtquelle mit dem Gerät in gutem Kontakt stehen;

Wärmeleitöl unter dem optischen Simulator auftragen, um die Wärmeleitung zu verbessern;

Öffnen Sie die Instrumentensoftware, wählen Sie das Modul „Kalibrieren“ und gehen Sie in das Programm „Temperaturkalibrierung“.

2. Kalibrierungsverfahren

Vorwärmung: Stellen Sie die Temperatur des Instruments auf 23 ° C und führen Sie das Vorwärmverfahren (etwa 10 Minuten) durch, um das Instrument in einen stabilen Zustand zu erreichen;

Temperaturpunkteinstellung: Wählen Sie 9 Temperaturpunkte (30 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 90 ℃, 95 ℃ usw.), jeder Temperaturpunkt dauert 2 Minuten (zur Messung von Temperaturfehlern, Gleichmäßigkeit und Volatilität);

Erwärmungs- / Kühlprozess: Erwärmung von 50 ° C auf 90 ° C (Messung der durchschnittlichen Erwärmungsgeschwindigkeit) und Abkühlung von 90 ° C auf 50 ° C (Messung der durchschnittlichen Abkühlungsgeschwindigkeit);

Datenerfassung: Das Instrument erfasst automatisch die eingestellte Temperatur (Ts), den tatsächlichen Temperaturdurchschnittswert (T1), die Temperaturschwankungen (T_v) und den maximalen Überschlag (T_os) für jeden Temperaturpunkt.

3. Ergebnisberechnung

Temperatur-Anzeigefehler: Temperatur = Ts - T1 (Anforderung ≤ ± 0,5 ℃);

Temperaturgleichmäßigkeit: Tu = T_umax - T_umin (T_umax ist der maximale Wert für alle Lochtemperaturen, T_umin ist der minimale Wert, erfordert ≤ 1,0 ℃);

Temperaturschwankungen: T_v = ± (T_max - T_min) / 2 (T_max ist der maximale Wert der einzelnen Lochtemperatur, T_min ist der minimale Wert, die Anforderung ≤ 0,2 ℃);

Maximale Temperatur: T_os = Tosmax - Ts (Tosmax ist der maximale Wert für alle Löcher, erfordert ≤ 3,0 ℃);

Durchschnittliche Erwärmungsgeschwindigkeit: v_up = (TB - TA) / tut (TB ist der durchschnittliche Temperaturpunkt von 90 ° C, TA ist der durchschnittliche Temperaturpunkt von 50 ° C, tut ist die Erwärmungszeit, erfordert ≥ 4 ° C / s);

Durchschnittliche Kühlgeschwindigkeit: v_down = (TB - TA) / tdo (tdo ist die Kühlzeit, erfordert ≥ 3 ° C / s).

Kalibrierung optischer Systeme

Das optische System ist für die Detektion von Fluoreszenzsignalen verantwortlich, deren Genauigkeit sich direkt auf die quantitativen Ergebnisse von Ct-Werten und Nukleinsäurekonzentrationen auswirkt. Die Kalibrierung von optischen Systemen erfordert eine spezielle Kalibrierplatte (z. B. AB7500 ROI-Kalibrierplatte), die die Empfindlichkeit und die Signalkonsistenz des Fluoreszenzdetektors anpasst.

1. Hintergrundkalibrierung

Ziel: Beseitigung von Störungen durch die Grundfluoreszenz des Instruments (z. B. elektronische Signale, Verschmutzung mit Verbrauchsmaterialien aus Kunststoff);

Schritte:

(1) Entfernen Sie die Hintergrundkalibrierplatte (5 Minuten bei Raumtemperatur platzieren, um Kondensation zu vermeiden);

(2) Laden Sie die Kalibrierplatte in das Instrument und führen Sie das Verfahren "Hintergrundkalibrierung" (ca. 30 Minuten);

(3) Die Software zeichnet das Hintergrundfluoreszenzsignal automatisch auf und generiert eine Hintergrundkorrekturdatei (automatisch im Folgeexperiment abgezogen).

2. ROI-Kalibrierung (Interessengebiet)

Ziel: Karten der Lochpositionen auf der Reaktionsplatte an den Instrumentendetektor, um sicherzustellen, dass das Fluoreszenzsignal von jedem Loch genau erfasst wird;

Schritte:

(1) Entfernen Sie die ROI-Kalibrierplatte (Standard- oder Schnellplatte, 5 Sekunden drehen und 2 Minuten zentrifizieren);

(2) Kalibrierplatten in das Instrument einladen und das "ROI-Kalibrierungsprozess" ausführen;

(3) Die Software nimmt automatisch ein Bild von jedem Filter auf und generiert eine ROI-Maske (ein grüner Kreis um jedes Loch angezeigt, der eine erfolgreiche Kalibrierung anzeigt);

(4) Wenn das Bild zu gesättigt ist (zu starke Fluoreszenz im Loch), muss die Belichtungszeit angepasst werden (z. B. von 2048 auf 1024 reduziert) und das Bild erneut erfasst werden.

3. Optische Kalibrierung

Zweck: Kompensation der physikalischen Auswirkungen des optischen Systems (wie die spektrale Reaktion des Filters) und Gewährleistung der Genauigkeit des Fluoreszenzsignals;

Schritte:

(1) Wählen Sie das Programm "Optische Kalibrierung", um die ROI-Kalibrierungsdatei zu laden;

(2) Ausführen des Programms (ca. 10 Minuten), die Software analysiert automatisch die spektralen Eigenschaften des Fluoreszenzsignals und erzeugt optische Korrekturdateien.

4. Farbstoffkalibrierung

Zweck: Die Genauigkeit des Fluoreszenzsignals verschiedener Farbstoffe (z. B. FAM, VIC, ROX) zu verifizieren, um die Zuverlässigkeit von Multi-Farbstoff-Experimenten zu gewährleisten;

Schritte:

(1) Entfernen Sie die Farbstoffkalibrierplatte (enthaltend mehrere fluoreszierende Farbstoffe wie CY3, CY5, FAM usw.);

(2) die Kalibrierplatte in das Instrument einladen und das Verfahren der "Farbstoffkalibrierung" ausführen;

(3) Die Software erfasst automatisch das Fluoreszenzspektrum jedes Farbstoffes und erzeugt eine Farbstoffkorrekturdatei (automatische Erkennung des Farbstoffsignals in den nachfolgenden Experimenten).

c) Ergebnis-Aufzeichnungen und Zertifikate

Nach Abschluss der Kalibrierung ist ein CNAS-zertifiziertes Kalibrierungszertifikat erforderlich, das Folgendes enthält:

(1) grundlegende Informationen zum Gerät (Modell, Seriennummer, Hersteller);

(2) Kalibrieren der Umgebungsbedingungen (Temperatur, Feuchtigkeit, Zeit);

(3) Kalibrierungsergebnisse (Temperaturfehler, Gleichmäßigkeit, Präzision des optischen Systems usw.);

(4) Unterschrift des Kalibrierungspersonals und des Prüfers;

(5) Qualifikation der Kalibrierungsorganisation (CNAS-Akkreditierungsnummer).

IV. Bemerkungen zur Korrektur

1. Kalibrierungszyklus

Es wird empfohlen, alle zwölf Monate eine vollständige Kalibrierung durchzuführen (gemäß den Anforderungen von JJF 04-2020);

Bei hohen Anwendungsfrequenzen (z. B. mehr als zehnmal täglich) oder kritischen Anwendungen (z. B. klinische Diagnose) kann es auf sechs Monate verkürzt werden.

Nach dem Umzug, der Reparatur oder dem Austausch von Schlüsselkomponenten wie Heizblöcken oder Detektoren ist eine Neukalibrierung erforderlich.

2. Professionelle Unterstützung

Die Kalibrierung muss von einem Hersteller-Ingenieur oder einer qualifizierten Drittanbieterorganisation durchgeführt werden (z. B. Tianjin Metrologische Überwachung und Prüfung Wissenschaftliche Forschungsinstitut), um sicherzustellen, dass die Einhaltung der SOP (Standard Operating Procedures);

Nicht-Profis dürfen die Instrumentparameter (z. B. Temperatureinstellungen, optische Filter) nicht selbst anpassen, um die Kalibrierergebnisse zu vermeiden.

3. Verifizierung nach der Kalibrierung

Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, müssen Standardsubstanzverifizierungsexperimente (z. B. Plasmid-DNA-Standardsubstanzen) durchgeführt werden, um die Wiederholbarkeit des Ct-Wertes (Variationskoeffizient ≤ 3%) und den linearen Korrelation-Koeffizienten (R² ≥ 0,99) zu erkennen, um die Kalibriereffekte zu gewährleisten;

Sollten die Prüfergebnisse nicht den Anforderungen entsprechen, müssen Sie sie neu kalibrieren oder sich an den Hersteller wenden.

5. Häufige Fragen und Lösungen

1. Die Temperaturgleichmäßigkeit entspricht nicht den Anforderungen

Ursache: medizinische Hitzeblock-Kontamination (z. B. verbleibende PCR-Produkte), Alterung des Temperatursensors;

Lösung: Reinigen Sie die Gleichheitsblöcke (mit wasserlosem Ethanol abwischen) und ersetzen Sie den Temperatursensor.

2. Niedrige Fluoreszenzsignalstärke

Ursache: ROI-Kalibrierung fehlgeschlagen (Loch-Mapping-Fehler), zu hohe Hintergrundfluoreszenz;

Behebung: Führen Sie die ROI-Kalibrierung erneut durch und führen Sie die Hintergrundkalibrierung aus (Austausch der Hintergrundkalibrierungsplatte).

C-Werte variieren stark

Ursache: Übermäßige Temperaturschwankungen (z. B. unstabile Heizblöcke), verminderte Empfindlichkeit des Fluoreszenzdetektors;

Lösung: Überprüfen Sie die Temperaturstabilität des Heizblocks (gemessen mit einem Mehrkanal-Temperaturverifikator) und ersetzen Sie den Fluoreszenzdetektor.

6. Zusammenfassung

Die Korrektur von fluoreszierenden quantitativen PCR-Messgeräten ist ein entscheidender Schritt, um sicherzustellen, dass die experimentellen Daten genau und zuverlässig sind, und erfordert die strikte Einhaltung von Industriestandards (z. B. JJF1527-2015, JJF (津) 04-2020) und die regelmäßige Kalibrierung von Temperaturregelsystemen und optischen Systemen. Während der Kalibrierung müssen die Umweltbedingungen, professionelle Unterstützung und die Validierung der Ergebnisse berücksichtigt werden, um sicherzustellen, dass die Leistung des Instruments den experimentellen Anforderungen entspricht. Durch einen standardisierten Korrekturprozess können experimentelle Fehler effektiv reduziert und die Genauigkeit und Wiederholbarkeit der qPCR-Ergebnisse verbessert werden.