Anatomie des Olympus-Fluoreszenzmikroskops

26.07.2018 07:52:45 Veröffentlicht von admin

Zusammen mit anderen auf der Grundlage von MakroprobenmerkenOptisches MikroskopIm Vergleich zu Mustern wie Phasengradienten, Lichtabsorption und Doppelbrechung ist das Fluoreszenzmikroskop in der Lage, die Verteilung einzelner Molekülarten nur auf der Grundlage der Eigenschaften der Fluoreszenzstrahlung abzubilden. Daher kann mit einem Fluoreszenzmikroskop die genaue Position der intrazellulären Komponenten überwacht werden, die mit einem bestimmten Fluoreszenzgrupp gekennzeichnet sind, sowie ihre zugehörigen Diffusionskoeffizienten, Transportmerkmale und andereBiologischemolekulare Wechselwirkungen. Darüber hinaus ermöglicht die bemerkenswerte Reaktion der Fluoreszenz auf lokale Umgebungsvariablen die Untersuchung von pH, Viskosität, Brechungsgrad, Ionenkonzentration, Membranpotential und Lösungsmittelpolarität in lebenden Zellen und Geweben.

Frühe Fluoreszenzmikroskopkonfigurationen mit klassischer Hellfeld- oder Dunkelfeldtransmission (Lichtdurchlässigkeit）Optische SystemeDas angeregte Licht wird durch den Filter auf die Probenebene fokussiert. Die Fluoreszenz-Emission und eine große Menge an stimulierter Beleuchtung werden durch das Objektiv gesammelt und durch einen zweiten Filter in die Brillenlampe projiziert, um ein Zwischenbild zu bilden. Da die Intensität des angeregten Lichts in der Regel mehrere Größengruppen größer ist als die Fluoreszenzstrahlung, sind die Probenansichten in diesen frühen Transmittionslichtmikroskopen in der Regel sehr kontrastlos und auf einen Hintergrund überlagert, der mit einer streuen angeregten Beleuchtung gefüllt ist. Die Beachtung der Probe in einem hohen Neigungswinkel mit einem Öl-Eindunkelfeldkonzentrator mit hoher Apertur hilft, den größten Teil des Hintergrundgeräuschs zu beseitigen, bietet jedoch mit Ausnahme von Objektiven mit niedriger Apertur keine ausreichende Beleuchtung. Die Bildauflösung ist schlecht und die Helligkeit ist sehr gering.

Fluoreszenzmikroskop und Eingangslicht (Reflektiertes LichtDie Beleuchtung wurde zuerst in den späten 1920er Jahren entwickelt, um die Fluoreszenzstrahlung in undurchsichtigen metallurgischen Proben zu beobachten. Wie ihre Hellfeld-Kollegen verwenden diese reflektierenden Leuchtfluoreszenzinstrumente einen Halb-Reflexionsstrahler mit einer Gesamteffizienz von etwa 25% (Verlust von 50% der Beleuchtung nach jedem Durchlaufen des Spiegels). Reflektierende Lichtfluoreszenzmikroskope genießen jedoch den Vorteil eines Objektivs mit einer hohen numerischen Apertur als Fokus und können ein deutlich höheres Bildniveau erzeugen als Transmittionslichtmikroskope, die unter ähnlichen numerischen Aperturen arbeiten. Darüber hinaus reduziert sich das differierte excitierte Licht des reflektierten Rückobjektivs (bei hohen numerischen Durchmessern) auf nur ein paar Prozent. Auch die doppelte Rolle des Objektivs im reflektierten Lichtmikroskop vereinfacht die Ausrichtungsaufgaben erheblich. Die Fokussierung des Objektivs nur auf die Probe bildet ein Beleuchtungsfeld und ein Sichtfeld, so dass das eingehende angeregte Licht und die beobachtete fluoreszierende Emission den gleichen Pfad durch die Mikroskopioptik folgen.

Als in den Mitte der 1930er Jahre kompakte Quecksilberdampf- und Xenonbogenentladungslampen entwickelt wurden, führten technologische Fortschritte bei der Beleuchtung der Lichtquellen zu einer Veränderung der reflektierten Photofluoreszenz (zumindest für die Metallographie). In dieser Zeit wurden auch Farbglas- und Gelatinfilter komplexer, was es ermöglichte, durch blaues und grünes sichtbares Licht angeregte fluoreszierende Farbstoffe mit Halogenwolfram-Lampen anzuwenden. Anti-Reflexionsbeschichtungen und verbesserte Glasformulierungen führten in den 1940er Jahren zu erheblichen Verbesserungen im Objektivdesign, aber ein grundlegender Beitrag zur Entwicklung des Eingangsfluoreszenzmikroskops war die Einführung des Bifarbspektrometrums (auch als Bifarbspiegel bekannt) von dem russischen Optiker Eugeny Brumberg, der 1948 begann. Diese Innovation überwindet das Problem des Lichtverlusts, das der Verwendung von normalen Halbreflektorn im Reflexionslichtmikroskop inhärent ist. Reflexionsfluoreszenzmikroskope wurden zunächst in den späten 1960er Jahren von Johan S. Ploem weit verbreitet, der eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Wild-Leitz Ploem Opak spielte, das mehrere austauschbare optische Module mit einer Vielzahl von Fluoreszenzmikroskopfiltern enthielt.

Grundlegende Strategien des Fallfluoreszenzmikroskops

Reflexionsfluoreszenzmikroskope sind in der überwiegenden Mehrheit die aktuellen Methoden der Wahl für die Breitfeldforschung von nicht kohärenten Lichtquellen, sowie diejenigen, die mit Laser-Scan-Kofokuss und Multi-Photonen-Instrumente durchgeführt werden. Dieses beliebte Fluoreszenzmikroskopmuster wird auch als Eingangsfluoreszenz, Reflexionsfluoreszenz oder einfache Fallfluoreszenz bezeichnet. Ein typisches modernes reflektiertes Lichtfluoreszenzmikroskop ist auch mit einer Vielzahl von kontrastverstärkten Modi ausgestattet, wie in Abbildung 1 gezeigt. Das Mikroskop enthält einen dreifachen Beobachtungskopf, gekoppelt an ein Ladungsgekoppeltes Gerät (CCD) Kamerasystem, mit zwei Beleuchtungsquellen, einer für die Durchlässigkeit des Lichts und die andere für die Beobachtung (Wolfram-Halogen- und Quecksilberbogen-Entladung). Dieses Mikroskop kann kombiniert oder abwechselnd reflektierte Lichtfluoreszenz mit transmittiertem Licht Phasenkontrast, Differential Interference Contrast (DIC), polarisiertes Licht oder Hoffman-Modulation Kontrast beobachten.

Das grundlegende Merkmal eines jeden Fluoreszenzmikroskops besteht darin, einen Mechanismus zur Anregung der Probe bereitzustellen, deren Beleuchtung selektiv gefiltert ist und die schwächere Fluoreszenzmission dann mit einem zweiten Filter zu trennen, um ein Bild mit großer Empfindlichkeit auf einem dunklen Hintergrund zu bilden. In vielen Experimenten waren die lokalen Sondenkonzentrationen in biologischen Proben sehr niedrig und nur ein kleiner Teil des stimulierten Lichts wurde von fluoreszierenden Substanzen absorbiert. Darüber hinaus emittiert der Prozentsatz der sekundären Fluoreszenz noch geringer bei denen, die eine gewisse Menge an Bestrahlung absorbieren können. Die erhaltene Fluoreszenz-Emissions-Helligkeitsniveau wird drei bis sechs Größengruppen niedriger als die Helligkeitsniveau der Beleuchtung sein. Das grundlegende Problem des Fluoreszenzmikroskops besteht daher darin, eine effiziente Beleuchtung der Probe zu erzeugen und gleichzeitig schwache Fluoreszenzmissionen zu erfassen, die effektiv von intensiveren Beleuchtungsbändern getrennt sind. Diese Bedingungen werden in modernen Fluoreszenzinstrumenten durch eine Kombination von Filtern erfüllt, die die Anregungs- und Emissionsanforderungen auf der Grundlage der Wirkung und Eigenschaften des Bifarbstrahlers koordinieren.

Abbildung 2 beschreibt das Prinzip hinter der Funktion eines bifarbigen Strahlers (Spiegel) im Reflexionsfluoreszenzmikroskop, das eine hypothetische Probe eines Fluorezors enthält, das eine rote Wellenlänge (620 bis 660 nm) im grünen Bereich (550 nm) anregt und emittiert. sichtbares Spektrum. Eine Lichtquelle mit hoher Intensität liefert eine breite Reihe von Anregungswellenlängen mit hoher Durchflussdichte (die in der Regel den größten Teil des UV-Strahls und das gesamte sichtbare Spektrum abdeckt), die durch die Beleuchtung hindurchgehen und zuerst auf einen Filter treffen, der das geeignete Anregungsband auswählt (gekennzeichnet als EF; siehe Abbildung 2 (a)). In diesem Fall passiert der Filter Licht mit einer Wellenlänge zwischen 510 und 560 nm mit hoher Effizienz, erlaubt aber auch andere Wellenlängen in kleinerem Umfang zu passieren. Das angeregte Licht erreicht dann den bifarbigen Spiegel (DM in Abbildung 2) und wird in das hintere Loch des Objektivs reflektiert, um eine konische Beleuchtung der beleuchteten Probe zu bilden. Der Bifarbspiegel befindet sich im Lichtweg mit einem Winkel von 45 Grad und ist dafür konzipiert, Wellenlängen zwischen 490 und 565 nm selektiv zu reflektieren (wie in Abbildung 3 gezeigt) und gleichzeitig kürzere und längere Wellenlängen zu übertragen.

Abbildung 3 zeigt die Transmissionskurve für die Kombination von Filtern, die das angeregte Licht von der fluoreszierenden Emission in Abbildung 2 trennen. Das Stimulationsfilterspektrum (rote Kurve) zeigt eine hohe Durchlässigkeit zwischen 510 und 560 nm (etwa 80%). Mittelwellenlänge (CWL) 535 nm. Bifarbige Spiegel (gelbe Kurve) reflektieren die Wellenlängen im spektralen Bereich, während sie mit relativ hoher Effizienz höhere und niedrigere Wellenlängen durchlaufen. Beachten Sie, dass die prozentuale Durchlässigkeit auf der zweifarbigen Spiegelkurve 100% Reflexion entspricht. Ein signifikanter Rückgang in der Transmissionsverteilung zwischen 490 und 570 nm (die den Spitzenwert der Reflexivität repräsentiert) wurde verwendet, um das Wellenlängenband aus dem Stimulationsfilter im Winkel von 90 Grad in die Probe zu reflektieren. Die letzte Komponente der optischen Serie, der Emissions- oder Barrierefilter (weiße Kurve), durchlässt Wellenlängen über 590 nm, was dem sichtbaren Licht mit gelbem, orangefarbenen und roten Farben entspricht. Die Grenzen zwischen den Transmissions- und Reflexionsbändern verschiedener überlagerter Spektren sind so steil wie möglich konzipiert, um sicherzustellen, dass Reflexions- und Transmissionswellenlängen fast * getrennt sind. Das Auftreten von Sinus-steigenden und fallenden Spitzen im Bifarbspektrum ist ein häufiger Effekt des Prozesses der Dünnfilm-Ablagerung, der als Ununterbrechendes Klingeln bezeichnet wird. Die ausgezeichnete Leistung dieser Filterkombination ist ein deutlicher Beweis für die schnelle Entwicklung der Dünnfilm-Interferenzfilter-Technologie.

Da nur das Licht mit enger Bandbreite vom Bifarbspiegel reflektiert wird, ist es möglich, die Beleuchtungswellenlängen von kürzeren als 490 nm und längeren als 565 nm des Filters durch den Bifarbspiegel zu übertragen, wie das Licht über dem Schnitt gezeigt wird. In Abbildung 2 (a). Beachten Sie, dass die Reflexion des angeregten Lichts nicht zu 100% wirksam ist, daher wird eine kleine Menge grünes Licht durch einen bifarbigen Spiegel reflektiert. Nicht alles Licht mit einer Wellenlänge größer als 565 oder weniger als 490 Nanometer geht durch den Spiegel. Ein kleiner Teil dieses Lichts wird vom Spiegel durch das Objektiv auf die Probe reflektiert.

Die fluoreszierende Emission der Probe, die durch grünes Licht angeregt wird (hauptsächlich rote Wellenlängen), wird von dem Objektiv gesammelt und durch den Bifarbspiegel und den Barrierefilter (über das abgeschnittene Licht in Abbildung 2 (c)) durchgeführt. Der Barrierefilter (in Abbildung 2 als BF gekennzeichnet) ist speziell dafür konzipiert, dass nur Licht mit Wellenlängen größer als 590 nm das Mikroskopiobjektiv und / oder den Detektor erreichen kann. Bei der Verwendung für diese Aufgabe verhindert der Barrierefilter effektiv, dass die stimulierte Lichtwellenlänge, die von der Probe reflektiert wird (und erfolgreich durch den bifarbenen Spiegel hindurchgeht), den Detektor erreicht. Allerdings reflektiert der größte Teil der Stimulationswellenlänge, die von der Probe zurückkehrt, durch einen Bifarbspiegel (Licht unter dem Abschnittslicht in Abbildung 2 (c)) auf den Stimulationsfilter und den Leuchtgeber. Der Nettoeffekt der in den Abbildungen 2 und 3 dargestellten Filterkonfiguration ist die Trennung einer deutlich höheren Intensität des angeregten Lichts von einer schwächeren Fluoreszenz-Emission. In allen Fällen, wie in der Abbildung gezeigt, ist das Schnittniveau des betroffenen Filters im Fluoreszenzmikroskop nicht, kann aber einige Licht außerhalb des Wellenlängenbereichs durchdringen. Die gesamte Ereignissereihenfolge ist in Abbildung 2 (b) grafisch dargestellt, die den optischen Pfad und die strategische Filteranordnung, die für ein effektives reflektierendes Lichtfluoreszenzmikroskop erforderlich ist, veranschaulicht.

Vertikale Fluoreszenzbeleuchtung

Der Kern des modernen Fluoreszenzmikroskops ist ein universelles reflektiertes Licht vertikale Beleuchtung, die in die Beobachtung Beobachtungsrohr und tragen ObjektiveObjektivezwischen den Konvertern, wie in Abbildungen 1 und 4 gezeigt. Die Beleuchtung ist entworfen, um das Licht zu leiten, das durch Hochlicht erzeugt wird - indem die Intensitätsquelle zuerst durch das Mikroskopiobjektiv in Richtung der Probe geführt wird und dann das Licht, das von der Probe ausgestrahlt wird, mit dem gleichen Objektiv erfasst wird. Diese Art von Beleuchtungsstrategie hat mehrere Vorteile. Das Mikroskopiobjektiv dient zunächst als gut korrigierter Fokus und sammelt dann die Bildfluoreszenz-Emission, um sie an ein Brille- oder Kameraendetektionssystem zu übertragen. Daher ist das Objektiv immer relativ zu jeder Funktion richtig ausgerichtet. Darüber hinaus wird der größte Teil des angeregten Lichts, das von der Probe gestreut oder reflektiert wird (im Winkel von 360 Grad), von den Linsenelementen der Objektivvorderseite entfernt und nicht direkt in das Glas projiziert, wie im Fall einer durchlässigen Fluoreszenzbestrahlung. Dieser Effekt wird als Frontbeleuchtung bezeichnet und eignet sich besonders für dicke Proben. Anschließend wird der beleuchtete Probenbereich auf denselben Bereich beschränkt, der beobachtet wurde, und sowohl die Beleuchtung als auch die Lichtsammlung können die vollständige Anzahl der Objektivaperturen nutzen.

Am entfernten Ende der vertikalen Beleuchtung befindet sich ein Lichtkasten (siehe Abbildung 4), das eine Lichtquelle mit einer hohen Intensität der Lichtbogenentladung oder einer Lichtquelle auf Seidenbasis enthält. Beliebte Beleuchtungsquellen sind Hochdruck-100-Watt-Quecksilberbogen-Lampen (HBO, allgemein als Brenner bezeichnet), aber Xenon- und Metallhalogenidbogen-Lampen, Laser und Wolfram-Halogenid-Glühlampen können auch für diesen Zweck verwendet werden. Das Licht, das von der Lichtquelle ausgestrahlt wird, wird vom Fokussierlinsensystem fokussiert und bewegt sich entlang der Beleuchtung, die parallel zum Tisch und senkrecht zur Mikroskopiachse ist. Das in Abbildung 4 dargestellte Lichtsender-Design enthält ein Multi-Komponenten-Kollektorlinsensystem, implementiert aber auch nicht-sphärische Linsenelemente zur Verbesserung der Farbdifferenzkorriktur in den nahen Infrarot- und UV-Bereichen. Wärmefilter, die zur Entfernung oder Unterdrückung von Infrarotwellenlängen konzipiert sind, werden in der Leuchtkastenmontage innerhalb der Leuchtkasten selbst oder in der Nähe der hinteren Vertikalbeleuchtung platziert. Darüber hinaus enthalten einige Mikroskope ein System in der Nähe des Dual-Frequenz- oder Multi-Frequenz-Stimulus-Balancer-Lichtkasten (siehe Abbildungen 4 und 8), das selektiv unerwünschte Wellenlängen des Stimulus filtert, um die Leistung der Fluoreszenzfiltergruppe, die am anderen Ende der Beleuchtung enthalten ist, fein einzustellen.

Ebenfalls in der Nähe des Lichtkastens in der vertikalen Beleuchtung befindet sich eine Reihe von neutralen Dichtefiltern, die verwendet werden können, um die Gesamtintensität des Lichts, das durch das System passiert, zu regulieren und die Fluoreszenzverlangung oder das Lichtbleichen zu verringern. Diese Filter werden in der Regel auf einem Schieberahmen montiert, so dass sie den Lichtweg schnell einfügen und aus dem Lichtweg entfernen können, während die Fluoreszenz der Probe beobachtet wird. Um die Köhler-Beleuchtung aufzubauen, enthält eine vertikale Beleuchtung eine lebensfähige Blende und eine Kombination aus Blickfeld-Lichtappendicen, die beide eine variable Blendenöffnung haben, die die Größe des Feldes und die Beleuchtungsintensität bestimmt. Durch mehrere Knopfpaare an jeder Außenseite des vertikalen Beleuchtungsgehäuses können die Durchmesser und das Lichtpaar sowie die Blendengröße angepasst werden. In einigen Designs ist ein Schiebeknopf zur Verfügung gestellt, der die gesamte Blendenkomponente aus dem Lichtweg entfernt, um die Lichtmenge zu maximieren, die durch die Beleuchtung passiert. Andere Mikroskope enthalten Nadellöcher von fester Größe, die auf einem Schieber montiert sind und einen Lichtweg einsetzen können, der das Beleuchtungsfeld erheblich einschränkt und für spezielle Anwendungen wie die Fluoreszenzrekurenz nach Lichtbleichung (FRAP) geeignet ist.

Nach der Feldlichtpendenz und der Lichtpendenz in der optischen Serie von vertikalen Beleuchtungsgeräten ist die Feldlinse erforderlich, um Licht zu verbreiten und genügend Beleuchtungsfelder zu erzeugen, um eine Kohler-Beleuchtung aufzubauen. Alle modernen vertikalen Beleuchtungsgeräte enthalten hinter dem Feldspiegel einen Lichtschluss (mit manueller Schaltsteuerung), der verhindert, dass stark angeregtes Licht in den Filtersatz und die Probe gelangt, wenn keine Fluoreszenz beobachtet oder aufgezeichnet wird. Der Verschluss ist ein wichtiges Merkmal des Fluoreszenzmikroskops, da die kontinuierliche Bestrahlung der Probe die Emission durch Lichtbleichung erheblich reduzieren kann, während hochintensives Licht für lebende Zellen ungesund ist. Darüber hinaus hält der Verschluss die Lichtbogen-Entladungslampe aktiv (reduziert die Vorwärmzeit), während die Probe sofort mit durchlässigem Licht geprüft wird. Fluoreszenzmikroskope sind in der Regel mit elektronischen Verschlüssen ausgestattet, die eine schnelle Fernsteuerung der Beleuchtung ermöglichen. UV-Schutz (der Atemschutz in Abbildung 4 ist an der Vorderseite des Beleuchtungsgehäuses installiert, um den Bediener vor versehentlichem Lecken potenziell gefährlicher Kurzwellen-UV-Strahlung zu schützen, wenn der Verschluss geöffnet wird. Der Schutz wirkt doppelt, indem er die Probe vor dem Ausatmen während der Beobachtung schützt.

Mehrere vertikale Beleuchtungskonstruktionen bieten Schlitze für rechteckige Polarisatorrahmen, die zur Fluoreszenzpolarisationsforschung verwendet werden können. In den meisten Fällen wird der Polarizer in den Beleuchtungsweg hinter dem Feldspiegel eingesetzt (weit weg von der Konjugationsebene), aber vor dem Lichtschloss (siehe Abbildung 4). Der Polarizer kann in einer vorgegebenen Transmissionsrichtung festgelegt oder an einem Zahnrad montiert werden, so dass die Richtung der Transmissionswelle durch die Verwendung von Fingerrädern geändert werden kann. Da der Polarizer in einem Schieberahmen installiert ist, kann er leicht aus dem Lichtweg entfernt werden, wenn er nicht verwendet wird. Der mitgelieferte Analyzer (der zweite Polarizer, der für die Fluoreszenz-Isometriemessung erforderlich ist) kann in einer vertikalen Beleuchtung über dem Filterblock-Rotatorturm oder in einem speziell entwickelten Polarisationsmikroskop-Zwischenrohr installiert werden. Die Hilfsrohre können in der Regel in eine gradiente rotierende Polarisationseinheit eingesetzt werden, um eine genaue Positionierung der Transmissionsrichtung des Analyzers relativ zur Polarisationsachse und der Mikroskopiachse sicherzustellen.

Die hintere Stufe der vertikalen Beleuchtung enthält einen Drehtisch oder einen Schiebehalter mit einem optischen Block, der eine Fluoreszenzfilter-Kombination enthält. Wenn eine Bildgebung mit einem bestimmten Fluoreszenzfilter kombiniert werden muss, drehen (oder schieben) die Filterblöcke in die optische Reihe. Ein einzelner Block enthält eine Reihe von passenden Stimulations- und Emissionsfiltern sowie ein Bifarbspektrometer, die alle sorgfältig positioniert sind, um die Beleuchtung der Probe zu maximieren und die Fluoreszenz-Emission einer bestimmten Wellenlänge zu erfassen. Der optische Block-Drehtürm und der Schiebehalter können drei bis sechs einzelne Blöcke tragen, von denen sich einer im Lichtweg befindet, während sich der andere Blöck im temporären Speicher dreht oder ausrutscht. Bei der Beobachtung von Proben, die mit zwei oder mehr Fluoreszenzsonden gekennzeichnet sind, können diese Zubehör schnell zwischen Fluoreszenzfiltergruppen umgewandelt werden. Die Verwendung von durchlässiger Beleuchtung in Mikroskopen mit Fluoreszenzbeleuchtung wird durch virtuelle optische Blöcke, die in einem Schlitz auf einem Drehtisch oder einem Schiebehalter montiert sind, erleichtert. Der virtuelle Block verhindert die Stimulierungsemission (wenn der Verschluss geöffnet ist), enthält jedoch keine Filter und erlaubt Licht vom Objektiv ungehindert durch die Beobachtungsröhre.

In einem Standard-modularen vertikalen Mikroskop befindet sich die vertikale BeleuchtungMikroskopZwischen dem Rahmen und dem Beobachtungsrohr (siehe Abbildung 1). Viele Hersteller bieten Zwischenrohre an, die zwischen Beleuchtung und Brilleneinheit für Polarisatoren, DIC-Prismen oder anderes Zubehör eingesetzt werden können. Moderne Mikroskoprahmen sind in der Regel das Ergebnis computergestützter Konstruktionsbemühungen, die zu erheblicher Vibrationsdämpfung und verbesserten ergonomischen Eigenschaften führen. Synthetische Materialien wie metallbasierte Keramik und Aluminium-Verbundwerkstoffe können die statische und thermische Steifigkeit des Rahmens erheblich verbessern, wodurch das Instrument den hohen Anforderungen fortschrittlicher Fluoreszenztechnologien standhalten kann, die Vibrationen für eine lange Zeit* zur Bildgebung schwacher Fluoreszenz-Emissionen eliminieren müssen.

Köhler Fluoreszenzmikroskop Beleuchtung

Bei fluoreszierenden vertikalen Beleuchtungen wird die Lichtquelle so positioniert, dass sich die Plasmakugel, die den Draht oder den Bogen entladt, in der Nähe des Hauptfokuss der Fokuslinse befindet. Bei der Köhler Beleuchtung wirken die Fokuslinsen als deutlich erhöhte Hilfslichtquelle zur Verbesserung der Gesamtbeleuchtung. Eine der wichtigsten Anforderungen an die Köhler-Beleuchtung ist, dass das Bild des Lichtdrahts oder des Lichtbogens endlich auf die hintere Fokusebene des Objektivs projiziert werden muss, die während der Anregung durch reflektierte Lichtbeleuchtung ebenfalls doppelt so groß ist wie der Fokus (in der Regel mit einer hohen numerischen Apertur). Idealerweise sollte die Lichtquelle die gesamte Objektivapertur füllen, um die Strahlungsintensität zu maximieren und ein gleichmäßig beleuchtetes Feld zu erzeugen. In einigen Fällen heiß). Da der Diffusionsfilter jedoch auch die Beleuchtung reduziert, sollte die Verwendung möglichst vermieden werden.

Bei der reflektierten Licht-Köhler-Beleuchtung (schematisch in Abbildung 5 dargestellt) wird das Bild der Lichtquelle mit einer Fokusslinse auf eine Apendice mit einer Apertur, die sich in einer vertikalen Beleuchtung befindet, fokussiert. Der Lichtappendix teilt eine Konjugationsebene mit dem hinteren Loch des Objektivs und dem Lichtbogen oder dem Lichtdraht und bestimmt somit die Größe der Beleuchtungsfeldöffnung. Die Lichtquelle, die vertikale Beleuchtungsapertur und die hintere Fokusebene des Objektivs (Lichtpupil) bilden zusammen eine Beleuchtungsgruppe der konjugierten Ebene. Im Gegensatz zum Transmittionslichtmikroskop werden die Apertur und die Lichtquelle auf der hinteren Aperturebene des Objektivs (die als Fokus fungiert) abgebildet, anstatt sich physisch an dieser Position zu befinden. Als zusätzlicher Vorteil dieser Konfiguration werden alle Hindernisse, wie z. B. die Irisöffnung, aus dem Lichtweg entfernt, wenn das Objektiv eine stimulierte Beleuchtung liefert oder ein Bild durch eine zusammengefasste Fluoreszenzstrahlung bildet. Ein- oder Ausschalten der Apertur-Licht-Appendix dient zur Steuerung des gestreuten Lichts und zur Regelung der Intensität der Beleuchtung (numerische Apertur), ohne die Größe des Beleuchtungsfeldes zu ändern. In Bildern beeinflusst die Anpassung der Apertur Lichtpendenz Helligkeit und Kontrast.

Die Bildgebung oder Feldgruppe der konjugierten Ebene bei reflektiertem Licht in der Köhler-Beleuchtung besteht aus einer Feldlichtpendenz, einer Probenoberfläche und einer mittleren Bildebene. Somit wird das Bild der Lichtquelle deutlich vom Fokus entfernt, wenn der Feldlichthang auf der Probenebene fokussiert ist, um ein gleichmäßiges Beleuchtungsfeld zu bieten. Das Licht des Sichtfelds steuert die Größe des Beleuchtungsfeldes, ohne die Beleuchtungsintensität des beobachteten Bereiches zu beeinträchtigen. In der Praxis sollte die Größe der Öffnung des Feldlichts möglichst klein sein, um den Bildkontrast zu erhöhen und den Lichtbleichgrad in nicht direkt beobachteten Bereichen zu verringern. Obwohl die Lichtintensität der meisten Lichtbogenentladungen und Lichtquellen nicht gleichmäßig ist, kann die Köhler-Beleuchtung das Probenfeld gleichmäßig beleuchten. Nach der richtigen Konfiguration des Mikroskops beleuchtet die Hinterfokusebene des Objektivs* und bietet einen gleichmäßig hellen Bereich von Rand zu Rand. Idealerweise badet die Köhler-Beleuchtung die Probe mit einer Sammlung von Wellenpräferenzen, die sich jeweils aus einzelnen Punkten an der Lichtquelle bilden, die in die Fokus-Apertur abgebildet werden. Bei einem richtig konfigurierten Fluoreszenzmikroskop ergibt sich ein Bildkontrast und eine Auflösung. Im Idealfall wird die Probe mit einer Reihe von zusammentreffenden Wellenpräferenzen gebadet, die jeweils durch verschiedene Punkte an der Lichtquelle erzeugt werden, die zum Fokus-Apertur bilden. Bei einem richtig konfigurierten Fluoreszenzmikroskop ergibt sich ein Bildkontrast und eine Auflösung. Idealerweise wird die Probe mit einer Reihe zusammengefügter Wellenpräferenzen gebadet, von denen jede von der Bildgebung bis zurSchwerpunktspiegelDurchmesser der Lichtquelle auf verschiedenen Punkten erzeugt. Bei einem richtig konfigurierten Fluoreszenzmikroskop ergibt sich ein Bildkontrast und eine Auflösung.

Lichtquellen und Leuchtturme

Für eine strenge quantitative Analyse im Fluoreszenzmikroskop muss die Bestrahlung der Probe zeitlich und räumlich über das gesamte Sichtfeld hinweg konstant sein. Die Instabilität im Laufe der Zeit spiegelt in der Regel die Schwankungen der Lichtstrahlung wider, die aufgrund von Änderungen der Stromausgang auftreten. Stattdessen stammen die häufig auftretenden räumlichen Störungen bei Lichtbogenluchten von einem Phänomen, das als Blinken bezeichnet wird, da sich die Plasmakugel auf der Elektrode hin und her bewegt. Blinken wird in der Regel durch Stromschwankungen, kleine Änderungen des Elektrodenwiderstands oder mechanische Vibrationen erzeugt. Drahtbasierte Lichtquellen, wie die beliebten Wolframhalogenidlampen, sind sehr stabil, wenn sie unter konstantem Gleichstrom mit einer regulierten Spannungsversorgung arbeiten. In der Regel sollte die Lichtquelle aufgrund ihres Spektralgehalts, der Leitungsgröße im Vergleich zum Bereich hinter dem Objektiv, der Raum- und Zeitstabilität sowie der Gleichmäßigkeit der Feldbeleuchtung gewählt werden. Besondere Aufmerksamkeit muss auch auf die Intensität der Lichtquelle geschenkt werden, da die schmalen Wellenlängen, die durch den Stimulationsfilter passiert werden, nur einen sehr kleinen Teil der Gesamtausgabe des Lichtemittenten umfassen.

Die wichtigsten Überlegungen bei der Auswahl einer Lichtquelle für das Fluoreszenzmikroskop sind mit den untersuchtenFluoreszenzfarbstoffQuantenproduktivität und Absorption im Zusammenhang mit der UV- und sichtbaren Licht-Spektralverteilung. Darüber hinaus muss die Lichtquelle mit der Empfindlichkeit des für die Aufnahme des Bildes verwendeten Detektors kompatibel sein, sei es menschliches Auge, herkömmliche Filme, optische Multiplikatoren, erweiterte Videoröhre oder Digitalkamerasysteme. Die Wahl hängt auch von der Beleuchtung ab. Die Verwendung von Lichtbogenentladungsquellen oder Wolfram-Halogenquellen erfüllt die Anforderungen an die Breitfeldfluoreszenzmikroskopie, während Kofokuss- und Multiphotonmikroskope an eine Vielzahl von Lasersystemen angepasst werden müssen. Die Verwendung von Wolfram- und Wolfram-Halogen-Glühlampen hat begrenzten Erfolg erzielt, da der größte Teil ihrer Emission in den roten und infraroten Bereichen des Spektrums stattfindet, während die meisten Fluorosphoren durch UV-, blaue und grüne Wellenlängen angeregt werden. Darüber hinaus ist die Lichtleistung der Bogenentladungslampe zehn bis hundertmal hell als die 12-Volt-Quartzhalogenlampe, die normalerweise für durchlässiges Licht verwendet wird. Eine beliebte Lichtquelle für Breitfeldfluoreszenzmikroskope ist die Quecksilberbogen-Lampe, die in der Regel in der Basismodellmikroskopkonfiguration enthalten ist. In einigen Fällen werden Xenon- und Metallhalogenidbogenlampen verwendet, aber diese sind in der Regel auf besondere Fälle beschränkt, in denen die Spektrum- und Intensitätsverteilung mit den spezifischen Anforderungen des Fluoreszentrums übereinstimmt.

Quecksilber- und Xenonlampen sind ähnlich gestaltet, mit Ausnahme der physischen Größe und des Gases im Glühbirnengehäuse. Die Quecksilberlampe enthält zwei Elektroden, die bei hohem Spannung in eine Quarzglaslampe versiegelt sind, die auch verdampftes Element Quecksilber enthält. Wenn die Stromversorgung eingeschaltet ist, wird eine Reihe von Hochspannungsimpulsen an die Elektrode gesendet, um einen kleinen Teil des Quecksilbergases zu ionisieren und die Lampe anzuzünden. Nach der Verbrennung sinkt die Spannung und das ionisierende Gas wird verwendet, um den Strom zu tragen und eine Plasmakugel zu erzeugen, die sich zwischen den beiden Elektroden bildet. Während der Lampenarbeit erzeugt die Verdampfung von Quecksilber eine große Menge an Wärme und Druck in der Glaslampe, was schließlich eine hohe Lichtintensität erzeugt. Das Licht, das von Quecksilberbogenlampen erzeugt wird, ist auch im UV- und sichtbaren Spektrumbereich kontinuierlich und konzentriert sich auf diskrete Wellenlängen von 365, 400, 440, 546 und 580 nm. Von UV bis Infrarot haben Xenonlampen eine gleichmäßigere Intensitätsverteilung im gesamten Spektrumbereich. Die Auswahl der fluoreszierenden Farbstoffe ist entscheidend für die Bestimmung der geeigneten Lichtquelle für das fluoreszierende Mikroskop. Einige Fluoreszenzsonden verfügen über einen Reizband, der mit einer hervorragenden Quecksilberlinie übereinstimmt, während andere Fluoreszenzsonden von einer gleichmäßigeren Verteilung der Beleuchtung durch Xenonlampen profitieren.

Die richtige Ausrichtung der Bogenluchten im Fluoreszenzmikroskop ist entscheidend, um eine Kohler-Beleuchtung zu erreichen und helle und dunkle Bereiche im Fluoreszenzbild zu vermeiden. Daher kann die Qualität des Lichtkastens in der Regel durch die Stabilität der richtigen Ausrichtung der Lichter und die Effizienz der Einstellknopfe beurteilt werden, die zur Ausrichtung verwendet werden. Der Lampenhalter sollte mit einer mittleren Schraube ausgestattet sein, damit das gebogene Bild im hinteren Loch des Objektivs zentriert ist, und das Lichtkasten sollte einen Infrarotfilter enthalten, um lange Wellenlängen in fernem Rot und Infrarot zu blockieren, wodurch eine große Menge an Wärme erzeugt wird. Einige Lichtboxen sind entworfen mit einem eingebauten Rotunterdrückungsfilter (z. B. Schott BG38) oder einem Schlitz für diesen Filter, um den roten Hintergrund zu beseitigen, der in einigen Anwendungen durch das Sichtfeld gesehen wird. Darüber hinaus sollte das Gehäuse selbst keine schädlichen UV-Wellenlängen lecken und vorzugsweise sollte ein Schalter zum automatischen Ausschalten der Lichter enthalten sein, wenn das Gehäuse während des Betriebs versehentlich geöffnet wird. Danach sollte das Lichtkasten robust genug sein, um einer möglichen Brennerexplosion während des Betriebs standzuhalten.

Die breite Vielfalt der Anwendungen des Fluoreszenzmikroskops erfordert in der Regel eine Reihe von Lichtquellen, um die Anforderungen spezifischer Fluoreszenz- und Bildgebungsbedingungen zu erfüllen. In einigen Fällen kann eine Kombination mit ultraempfindlichen Kamerasystemen eine sehr geringe Strahlung erfordern, während für andere Studien eine starke Laserstimulation erforderlich sein kann, um lebende Zellen zu töten oder selektiv Fluoreszen zu bleichen. Die Wellenlängenanforderungen erstrecken sich in der Regel über den gesamten sichtbaren Bereich des Spektrums sowie über Teile des UV- und Infrarotstrahls. Da eine einzelne Lichtquelle diese vielfältigen Beleuchtungsanforderungen nicht erfüllen kann, können nun von Herstellern angebotene Adapter zwei oder mehrere Lampen gleichzeitig an ein einzelnes Mikroskop anschließen.

Fluoreszenzfilter-Kombination

Wie bereits erwähnt, trifft die Linse und das Lichtende, das durch die vertikale Beleuchtung hindurchgeht, auf einen in einem optischen Block aufgenommenen Erregungsfilter, der so positioniert ist, dass der axiale Kreuzungspunkt zwischen dem Lichtweg der Beleuchtung und dem Mikroskopioptiksystem übereinstimmt. Der Stimulationsfilter wählt eine schmalebandige Wellenlänge aus dem breiten Spektrum aus, das durch das Licht erzeugt wird, und überträgt sie an einen Bifarbspiegel, der wiederum das Licht durch das Objektiv reflektiert und auf die Probe strahlt. Bevor ein Bild in einer festen Brillenlampe gebildet wird, passiert die Fluoreszenzstrahlung, die vom Objektiv gesammelt wird, erneut durch einen Bifarbspiegel und einen Emissions- oder Barrierefilter. Zu den häufig verwendeten Filtern zur Trennung von Banden in Breitfeldfluoreszenzmikroskopen gehören Farbglasfilter und Interferenzfilm-Filter (oder eine Kombination beider). Die Festlegung des geeigneten Filters für jeden Schritt in einem Fluoreszenzmikroskop-Beleuchtungs- und Bildgebungsschema kann Verwirrung verursachen, da eine große Anzahl von Filterherstellern involviert ist, die jeweils eine proprietäre alphanumerische Namensmethode für die Fluoreszenzliteratur anbieten.

Abbildung 7 zeigt die typischenFluoreszenz-StimulationsblockDie anatomische Struktur, sowie die zugehörigen spektralen Konturen der bifarbigen Spiegel, Stimulation und Barrierefilter. Die Filterblöcke werden in der Regel durch maßgeschneiderte Werkzeuge des Herstellers montiert, so dass der Bediener Filter und Bifarbspiegel austauschen kann. Die Anregungs- und Barrierefilter werden durch eine Fixierklemme, einen optischen Kleber oder einen Rundgewinde-Befestigungssitz befestigt (siehe Abbildung 7). In der Regel können diese Filter entfernt werden, ohne die optischen Blöcke zu öffnen, da sie sich über Einnehmungen auf flachen Außenoberflächen befinden. Der Austausch des zweifarbigen Spiegels ist schwieriger und erfordert einen * demontierbaren Block, um ins Innere zu gelangen. Die meisten Blockteile werden mit 45 Grad diagonalen Verbindungen gegossen und ermöglichen eine doppelte Aufgabe, indem sie das Innere schützen und den bifarbenen Spiegel in einem geeigneten Winkel stützen. Nach dem Entfernen der Befestigungsmittel (Pin oder kleine Schraube), die den Körperteil miteinander befestigen, können Sie den Spiegel entfernen, indem Sie die Befestigungsklammer lösen oder bewegen und sie vorsichtig aus dem Körper entfernen. Zweifarbige Spiegel sollten vorsichtig behandelt werden, da die Interferenzbeschichtung in der Regel nicht geschützt ist und leicht kratzen kann. Mehrere Filterhersteller, die Mikroskopfirmen liefern, bieten auch eine Vielzahl von Aftermarketfiltern und Bifarbspiegeln für eine Vielzahl von Fluoreszenzanwendungen an. Nach dem Entfernen der Befestigungsmittel (Pin oder kleine Schraube), die den Körperteil miteinander befestigen, können Sie den Spiegel entfernen, indem Sie die Befestigungsklammer lösen oder bewegen und sie vorsichtig aus dem Körper entfernen. Zweifarbige Spiegel sollten vorsichtig behandelt werden, da die Interferenzbeschichtung in der Regel nicht geschützt ist und leicht kratzen kann. Mehrere Filterhersteller, die Mikroskopfirmen liefern, bieten auch eine Vielzahl von Aftermarketfiltern und Bifarbspiegeln für eine Vielzahl von Fluoreszenzanwendungen an. Nach dem Entfernen der Befestigungsmittel (Pin oder kleine Schraube), die den Körperteil miteinander befestigen, können Sie den Spiegel entfernen, indem Sie die Befestigungsklammer lösen oder bewegen und sie vorsichtig aus dem Körper entfernen. Zweifarbige Spiegel sollten vorsichtig behandelt werden, da die Interferenzbeschichtung in der Regel nicht geschützt ist und leicht kratzen kann. Mehrere Filterhersteller, die Mikroskopfirmen liefern, bieten auch eine Vielzahl von Aftermarketfiltern und Bifarbspiegeln für eine Vielzahl von Fluoreszenzanwendungen an.

Das Fluoreszenzfilter-Design umfasst eine Reihe von Long-Pass-, Short-Pass (Edge-Filtern) sowie Schmalband-, Mittelband- und Breitband-Filtern. Das in Abbildung 7 dargestellte Spektrum zeigt Beispiele für mehrere gängige Filterkonturen. Das Emissionsfilterspektrum (blaue Kurve) in Abbildung 7 wird durch einen Langpassinterferenzfilter mit einer Schnittwellenlänge von etwa 575 nm erzeugt. Längere Wellenlängen werden durch den Filter übertragen, während kürzere Wellenlängen blockiert werden. Der Schmalbandpass-Stimulationsfilter aus der gleichen Gruppe (rote Kurve, Abbildung 7) hat eine Bandbreite von etwa 20 nm, während der Bifarbspiegel (grüne Kurve) einen Durchlässigkeitsbereich von etwa mittleren (455-490 nm) und der Breitbandpass-Filter (560) -775 nm) hat. Da Bifarbspiegel effektiv als Langpassfilter in Grün verwendet werden, werden die gelben und roten Bereiche des sichtbaren Spektrums (560 bis 700 nm) in einer Filtergruppe verarbeitet. Die Arbeitskenntnisse darüber, wie die Fluoreszenz-Absorption und Emissionsspektrumverteilung zur Auswahl der geeigneten Fluoreszenzmikroskop-Filter-Set verwendet werden, sind für die erfolgreiche Umsetzung der Technik.

Bifarbige Spiegel (oder Strahlenspiegel) sind ein Schlüsselkomponent in der Fluoreszenzmikroskopfilterkombination, ähnlich einem Langpass-Interferenzfilter, der als Toleranz für mehrschichtige dielektrische Materialien hergestellt wird. Der Hauptunterschied zwischen einem bifarbigen Spiegel und einem Standard-Interferenzfilter besteht darin, dass der Spiegel speziell für die Reflexion und Transmission unter einer begrenzten Grenzwellenlänge konzipiert ist und im Winkel von 45 Grad gegenüber der Mikroskop- und Lichtemitter-Achse betrieben werden muss. Positionieren Sie den Bichrom-Spiegel so, dass die Interferenzbeschichtung auf die excitierende Lichtquelle ausgerichtet ist, so dass die kurze excitierende Wellenlänge durch das optische System in einem Winkel von 90 Grad auf die Probe reflektiert wird. Dieselbe Spiegel muss auch als Transmissionsfilter wirken, um die Fluoreszenzstrahlung mit langer Wellenlänge vom Objektiv auf eine ähnliche Ebene zu übertragen. Da der Wellenlängenübergangsbereich zwischen fast vollständiger Reflexion und großer Transmission in der Regel auf 20 oder 30 Nanometer beschränkt ist, können Bichrome-Spiegel die Wellenlängen von Anregung und Emission genau unterscheiden.

Der Fluoreszenzfiltersatz ist so konzipiert, dass ein bestimmtes Stimulierungswellenlängenband genau mit dem Reflexionsbereich im Bifarbspiegel übereinstimmt. Das Ergebnis ist, dass das stimulierte Licht effektiv über das Mikroskop auf die Probe reflektiert wird. Die fluoreszierende Emission der Probe muss mit dem hohen Durchlässigkeitsbereich im Bifarbspiegel übereinstimmen, damit diese Wellenlängen durch den Detektor passieren können. Barrierefilter sind im gesamten Programm weniger wichtig, spielen aber immer noch eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von Stimulierungswellenlängen von Streuung und Reflexion, Fluoreszenz von Sonden außerhalb des Ziels und der allgemeinen Hintergrundintensität, die durch spontane Fluoreszenz verursacht wird. Ein wichtiger Faktor bei der Erstellung einer Filtergruppe ist sicherzustellen, dass die Emissionskurve der Transmission, Reflexion und des betreffenden Filters mit der Emissionskurve des entsprechenden Bereiches übereinstimmt. Ansonsten kann die Stimulationswellenlänge durch einen bifarbigen Spiegel passieren und das Bild verschwimmen, oder die Fluoreszenzstrahlung kann versehentlich am Spiegel reflektiert werden, um die Helligkeit des Bildes zu beeinträchtigen.

Selbst bei scheinbar perfekt passenden Filterkombinationen kann es zu leichten Überlappungen zwischen den Spektralverteilungen der einzelnen Filter kommen, die die Leistung verringern. Besondere Aufmerksamkeit verdient die Interferenz zwischen dem Stimulationsfilter und dem Bifarbspiegel, der es ermöglicht, dass einige Stimulationslichte durch den Spiegel und von der Wand des Filterblocks reflektiert werden. Wie oben erwähnt, kann Licht, das in einem hohen Neigungswinkel reflektiert wird, teilweise durch einen Barrierefilter passieren, um den Bildkontrast zu verringern. Diese Leckage durch einen Filter, die als Penetration oder Kreuzung bezeichnet wird, tritt in der Praxis mehr oder weniger bei allen Filterkombinationen auf. Einer der wichtigsten Schwerpunkte von Filterherstellern und Mikroskopfirmen ist die Verbesserung der Konstruktion von Fluoreszenzfilterkombinationen, um die Kreuzungsniveaus zu senken.

Mehrere Konfigurationen der Fluoreszenzfiltergruppe sind in Abbildung 8 dargestellt. Der Filterblock-Rotationsturm (Abbildung 8 (a)) enthält fünf Blöcke, die schnell zwischen Filterkombinationen umgewandelt werden können, während mindestens diese Menge an Fluoreszen untersucht wird. Einer der Turnturmschlitze wird in der Regel mit virtuellen optischen Blöcken gefüllt oder leer gelassen, um durchlässiges Licht zu beobachten. Verwenden Sie einen Stimulus-Balancer (Abbildung 8(b)), um das Stimulationsspektrum fein einzustellen, um eine doppelt oder mehrfach markierte Probe zu bilden, die einen einzelnen Interferenzfilter enthält, der an einem Drehverbinder montiert ist. Der Regler des Rotationsregelungsbalancers bewegt den Banddurchgangsbereich des Filters auf kürzere Wellenlängen. Wenn der Balancerfilter somit von einem Eingangswinkel von Null (senkrecht zur vertikalen Beleuchtungsachse) auf einen großen Drehwinkel von 45 Grad gedreht wird, kann der Banddurchgangsbereich des Filters den Wert zwischen 25 und 50 Nanometern verschieben. Der excitationsbalancer kann einzeln oder in Reihe verwendet werden, um die excitationsbandbreite des fluoreszierenden Farbstoffs unter Beobachtung zu ändern, so dass die Emissionsintensität gleich ist. Diese Eigenschaft ermöglicht es, die Fluoreszenzintensität in einer Probe, die mehrere Sonden enthält, fein einzustellen, zum Beispiel um die Fluoreszenz-Emission von einer Sonde zu reduzieren und gleichzeitig die Intensität einer anderen zu erhöhen. Der excitationsbalancer kann einzeln oder in Reihe verwendet werden, um die excitationsbandbreite des fluoreszierenden Farbstoffs unter Beobachtung zu ändern, so dass die Emissionsintensität gleich ist. Diese Eigenschaft ermöglicht es, die Fluoreszenzintensität in einer Probe, die mehrere Sonden enthält, fein einzustellen, zum Beispiel um die Fluoreszenz-Emission von einer Sonde zu reduzieren und gleichzeitig die Intensität einer anderen zu erhöhen. Der excitationsbalancer kann einzeln oder in Reihe verwendet werden, um die excitationsbandbreite des fluoreszierenden Farbstoffs unter Beobachtung zu ändern, so dass die Emissionsintensität gleich ist. Diese Eigenschaft ermöglicht es, die Fluoreszenzintensität in einer Probe, die mehrere Sonden enthält, fein einzustellen, zum Beispiel um die Fluoreszenz-Emission von einer Sonde zu reduzieren und gleichzeitig die Intensität einer anderen zu erhöhen.

Die rasante Entwicklung der Dünnfilmbeschichtungstechnik kann durch die Fähigkeit zur Erzeugung mehrerer Transmissionsspitzen in einem einzelnen Interferenzfilter und zur Herstellung von kreuzenden Reflexions- und Transmissionsbändern in Bifarbspiegeln demonstriert werden. Bei richtiger Übereinstimmung können zwei Mehrbandfilter und ein Bifarbspiegel kombiniert werden, um mehrere Fluoreszenzfiltergruppen zu erzeugen, die die Emission mehrerer Fluoreszenzgruppen gleichzeitig anregen und beobachten können. Die Filtereinheiten sind vom Hersteller erhältlich und eignen sich für zwei, drei oder sogar vier Fluoreszene in derselben Probe. Das Hauptproblem mit mehreren Filtergruppen ist ihre Kosten und die übermäßige Kreuzung oder Penetration, die auftritt, wenn die Emission von einer Fluoreszenzsonde durch einen Banddurchgangsbereich, der für eine andere verwendet wird, passiert. In einigen Proben (und Filtergruppen) hat die Penetration einen signifikanten Einfluss auf die Hintergrundstärke und den Bildkontrast. Viele Forscher neigen dazu, die Bildgebung jedes Fluorospheres einzeln mit einem optimierten Filtersatz zu verwenden und anschließend das Bild zu einem Komplex zu kombinieren.

Fortgeschrittene Fluoreszenztechnologien erfordern in der Regel die Verwendung mehrerer Anregungs- und Emissionsfilter mit einem einzelnen Bifarbspiegel. Um diese Studien zu erleichtern, sind viele Fluoreszenzmikroskope mit einem elektrischen Filterrad oder einem Schieber ausgestattet, der zusätzlich sechs separate Filter enthält (siehe Abbildung 8 (c)). Ein Mikroskop, das entworfen ist, um einen Schieber einzusetzen, oder ein spezieller Schlitz für die Einführung eines Schiebers in einer vertikalen Beleuchtung, oder ein Filterschieber kann einen Schieber ersetzen, der normalerweise einen neutralen Dichtefilter enthält. In einigen Mikroskop-Konstruktionen können vertikale Lichtemittenten auch den Emissionsschieber aufnehmen oder zusätzliche Zwischenrohre zwischen dem Lichtemittenten und dem Beobachtungsrohr installiert werden, um den Schieber aufzunehmen. Bei vertikalen und umgekehrten Mikroskopen werden elektrische Filtereinheiten mit Stimulationsfiltern in der Regel in den vertikalen Beleuchtungsoptischen Pfaden zwischen dem neutralen Dichtefilter und dem Lichtkasten eingeschlossen. In ähnlicher Weise wird die elektrische Emissionsfiltereinheit im vertikalen Mikroskop-Design zwischen der vertikalen Beleuchtung und dem Brillenbeobachtungsrohr platziert, ist jedoch in der Regel über den gleichen externen Anschluss verbunden wie der Detektor, der für Umkehrgeräte verwendet wird. Motivations- und Emissionsschieber und elektrische Filterräder sind für Doppel- und Dreifach-Motivationsanwendungen mit einzelnen Doppelspiegeln sehr nützlich. Durch die Beseitigung der Notwendigkeit, die Filterblöcke bei der Beobachtung einzelner Proben neu zu positionieren, ermöglichen diese Anhänge es den Forschern, eine genaue Zuordnung zwischen den Bildern zu erhalten.

Objektive des Fluoreszenzmikroskops

In allen Formen der reflektierten Lichtmikroskopie (einschließlich Fluoreszenz) ist die Bildintensität eine Funktion der numerischen Apertur des Objektivs und der Vergrößerungsrate. Tatsächlich erhöht die Intensität oder Helligkeit (definiert als der Photonenstrom pro Einheit Fläche und Zeit) die numerische Apertur um das Viermate, aber nur im umgekehrten Verhältnis zum Quadrat der Vergrößerung:

Stärke α (NA obj) 4 / m2

wobei NA die numerische Objektivapertur ist und M. das Vergrößerungsvermöglichte ist. Aus dieser Beziehung ist offensichtlich, dass helle fluoreszierende Bilder durch hoheNumerischer Durchmesserund Objektive mit niedriger Vergrößerung (z. B. 0,75 / 20x) sammeln. Zum Beispiel erzeugt ein 60x-Schema-Komplex-Farbdifferenz-Ölimmersionsobjekt mit einer numerischen Apertur von 1,4 theoretisch ein 100-mal helleres Bild als ein Objektiv mit der gleichen numerischen Apertur, aber Kompromisse müssen berücksichtigt werden. Eine Erhöhung der Anzahl der inneren Linsenelemente (wie bei Objektiven mit hoher numerischer Apertur) führt zu einer spontanen Fluoreszenz und einer entsprechenden Erhöhung der intensitätsverringerten Reflexion von der inneren Linsenoberfläche. In der Regel machen Hersteller Kompromisse zwischen hohen Korrekturfaktoren und erhöhter Lichtdurchlässigkeit in ihren empfohlenen Fluoreszenzmikroskopiobjektiven.

Im Allgemeinen erzeugen hohe numerische Aperturen Öl (1,3 bis 1,4) und Wasser (1,2) Eintauchprogramm Fluorescent und flache komplexe Farbdifferenz Objektive helle fluoreszierende Bilder aufgrund ihrer großen Fokussierungsfähigkeit. Diese Objektive zeigen eine hervorragende Farbkorrektur und können daher mehrere fluoreszierende Wellenlängen auf derselben Ebene fokussieren. Die Lichtdurchlässigkeit von komplexen Farbdifferenzen und Fluorescenzobjektiven ist* bei niedrigen Werten von etwa 350 nm, was die Prüfung von fluoreszierenden Farbstoffen (z. B. DAPI, Hoechst, Alexa Fluor-350 und AMC) im UV-Bereich erfordert. Obwohl es viele interne Objektive gibt, werden diese Objektive aus niedrig fluoreszierendem Glas mit einer reflexionsbeständigen Beschichtung hergestellt, um die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren und ein sehr hochkontrastisches Bild zu erzeugen.

Speziell für spezielle Anwendungen entwickelte Objektive werden weit verbreitet im Fluoreszenzmikroskop eingesetzt. Diese Kategorie umfasst Wassereintauchen mit hohen numerischen Aperturen, mehrfache Eintauchen (Öl, Wasser und Glycerin) sowie UV-Objektive mit Quarzlinsenelementen. Für lebende Zellbildverarbeitungsanwendungen ist ein langdistanziertes Objektiv mit Korrekturringen erforderlich, um die Probe durch dicke (0,5-2 mm) Kulturflaschenwände zu beobachten. Die Inspektion dicker Probenteifen wird durch Objektive mit sehr langem Brennabstand (Arbeitsabstand) erleichtert, die von mehreren Herstellern zur Bildgebung mit einer durch Luft oder Wasser bedeckten Brille erhältlich sind. Langstrecken-Eintauchobjekte, die für den Einsatz ohne Abdeckschiene konzipiert sind, verfügen ebenfalls über einen vorderen Teflon-Kegel, so dass das Objektiv in eine wasserliche Lösung eingetaucht werden kann. Ähnliche Objektive werden durch UV-Anregung (340 nm) im Wasser bei Arbeitsabständen von 20 bis 30 mm (einschließlich ca. 5 mm Wasser) erzeugt. Für eine relativ niedrige Vergrößerungsstudie wird empfohlen, ein 20-faches Immersionsobjekt mit einer * numerischen Apertur (0,75 bis 0,95) zu verwenden. Obwohl sie sehr teuer sind, erzeugen diese Objektive extrem helle Bilder bei unbedeutenden Fluorescentkonzentrationen und / oder Quantenentwicklungen.

Fluoreszenzmikroskop Zubehör

Hersteller produzieren kontinuierlich nützliche Zusatzeinheiten für ihre Instrumente, um die verfügbaren Optionen für die wachsenden Bildverarbeitungsanwendungen im Fluoreszenzmikroskop zu erhöhen. Beispielsweise kann auf einigen Mikroskopen eine rechteckige Feldlichtpendenz (siehe Abbildung 9) gewählt werden, die den beachteten Probenbereich begrenzen kann, um den Kontrast zu erhöhen und das Lichtbleichen zu verringern. Der modulare Feldlichtpendel ersetzt den herkömmlichen Blendenpendel (auch als abnehmbares Modul) in vertikalen Beleuchtungen und ist für das Längenverhältnis eines digitalen Bildgebers konzipiert. Rechteckfeldstillstand verbessert die Effizienz der Kohler-Beleuchtung und verringert das Signal-Rausch-Verhältnis der elektronischen Sensoren. Als zusätzlicher Vorteil kann die Größe des Bildrechteckes angepasst werden, um den Schritt der Phase anzupassen, wenn eine programmierbare Scanstufe in der Anti-Konversionsstudie verwendet wird. Die Nadellöcher ähneln den rechteckigen Feldlichthängern und können für Anwendungen verwendet werden, die ein sehr begrenztes Beleuchtungsfeld erfordern.

Zu den weiteren Zubehörteilen gehören ein Dual-Light-Gehäuseadapter, mit dem zwei Lichtquellen wie Quecksilber- und Xenonbogenentladungslampen gleichzeitig an eine vertikale Beleuchtung angeschlossen werden können. Beleuchtungsgeräte für die Anregung von Lasern können auch für Anwendungen wie Full-Internal Reflective Fluorescence (TIRF), Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskop (FLIM), Verhältnis-Bildgebung und Lichtbleichung-Erholungsexperimente verwendet werden. Darüber hinaus bieten die meisten Forschungsgrad-Fluoreszenzmikroskope von den führenden Herstellern leicht an ihre jeweiligen Laser-Scan-Kofokus-Zubehör anzupassen. Ein vertikales Mikroskop empfängt eine konfokale Scaneinheit über ein dreifaches Beobachtungsrohr, während ein umgekehrtes Instrument den Strahlscanner an den seitlichen oder hinteren Anschluss des Mikroskoprahmens anschließt. Doppelte Anschlüsse zwischen der vertikalen Beleuchtung und dem Beobachtungsrohr können verwendet werden, um zusätzliche Lichtquellen einzuführen oder Fluoreszenz auf mehr als einen Detektor zu leiten. Die meisten dieser Geräte sind mit einem optionalen C-Montagedapter oder einem Standard-Mikroskopfortzubehör ausgestattet.

Fluoreszenzmikroskope für die elektrophysiologische Forschung sind sehr komplex geworden. Viele sind mit speziellen Schockdämpfungsgraden ausgestattet, die eine Vielzahl von Mikromanipulatorteilen für die Verwendung von Fluoreszenz, Infrarot-Differenzialinterferenzkontrast (IR-DIC) und herkömmliche Lichtfeldkontrastverbesserte Bildgebungstechniken akzeptieren können. Die Drehplatte für Tierobjektive ermöglicht einen schnellen, vibrationsfreien Austausch von Objektiven, um das Eindringen von Proben oder Blasen bei der Bildgebung lebender Zellen und Gewebe zu verhindern. Die Fluoreszenzmakroskopie in Organismen kann mit den neuen 2x- und 4x-Mikroobjektiven (Objektive) mit hohen numerischen Öffnungen über lange Arbeitsdistanzen durchgeführt werden, die mit speziellen Filterkombinationsblöcken ausgestattet sind. Darüber hinaus bieten einige Hersteller auch fluoreszierende vertikale Beleuchtungen und Filtersätze als Zubehör für ihre Stereomikroskope an.

Vertikale Beleuchtungen können manchmal einen Vergrößerungskoeffizienten von 1,25 bis 1,5 Mal als Option wählen, aber aufgrund der inhärenten Probleme mit der Einführung von leeren Vergrößerungen sollte die Verwendung von Hilfsobjektiven, um in das Fluoreszenzbild einzutreten, so weit wie möglich vermieden werden. Mehrere modulare vertikale Beleuchtungskonstruktionen umfassen Geräte, die zum Anschluss von Strahlermodulen verwendet werden, die mehrere Kameraanschlüsse oberhalb der Beleuchtung enthalten sind, um die Bildleistung zu erhöhen. Angesichts der vielfältigen elektrischen Zubehör, das jetzt für Fluoreszenzmikroskope verfügbar ist, einschließlich Objektiv-Drehplatten, Fokus, Filterräder und Plattformen, haben die Forscher Zugang zu komplexeren Bildgebungstechnologien wie je zuvor. Hersteller haben viel Aufwand in das Design von Zubehör für viele komplexe Fluoreszenzanwendungen investiert, die früher nur mit Mikroskopen gebaut wurden, die Teile aus verschiedenen Quellen stammen. Da das Fluoreszenzmikroskop zu einem immer wichtigeren Werkzeug in der Zellbiologie, der Neurophysiologie und der Klinik wird

Umkehrtes Fluoreszenzmikroskop Design

Ähnliche Versionen von vertikalen Fluoreszenzbeleuchtungen können für umgekehrte (Gewebekultur) Mikroskopständer verwendet werden. Der umgekehrte Halter ermöglicht auch die Kombination oder den Wechsel zwischen verschiedenen Kontrastverstärkungstechnologien für Reflexionsfluoreszenz und Transmittionsmikroskope. Umkehrtes Mikroskop auf Forschungsgrade hat mehrere (mehr als sechs) Ein-/Ausgangsanschlüsse, in der Regel einen einzelnen Anschluss an jeder Seite des Rahmens, sowie einen oder zwei Anschlüsse (oberen und unteren) auf der Rückseite und ein unteres Anschlüsse-Mikroskop unterhalb In einigen Modellen kann das Hauptbild von drei oder mehr Anschlüssen gleichzeitig ohne die Verwendung eines Relais-Objektivs erhalten werden. Diese Verbindungsebene ermöglicht eine komplexe Fluoreszenzanalyse mit mehreren Lichtquellen, Filterrädern und Kamerasystemen. Quecksilber- und Xenonlampenbekleidungen für umgekehrte Mikroskope können mit Standard-Multi-Komponenten- oder nicht-sphärischen Fokusionslinsen verwendet werden, um die Leistung zu verbessern und Abweichungen in den UV- und Infrarot-Spektralbereichen zu verringern. Darüber hinaus können verschiedene Lichtkastendapter verwendet werden, um mehrere Beleuchtungsquellen anzuschließen, ähnlich dem Zubehör, das für ein vertikales Mikroskop verwendet werden kann.

Abbildung 10 zeigt eine Profildarstellung eines modernen umgekehrten (Gewebekultur) Fluoreszenzmikroskops mit Peltier-gekühlten CCD-Bildsensoren und einem herkömmlichen 35-mm-Filmkamera-System. Trotz des FilmsKameraDie Verwendung ist begrenzt, aber die meisten Umkehrmikroskope enthalten immer noch die Anschlüsse für diese Zubehör im unteren Teil der vorderen Basis. Das in Abbildung 10 dargestellte Mikroskop kann mit einem auf einer Säule montierten Wolfram-Halogen-Lampenkasten herkömmliche Lichtfeld-Transmittenzbeleuchtung durchführen (mit oder ohne Kontrastverstärkung). Quecksilber- oder Xenonbogen-Entladungslampen werden für Fluoreszenzmikroskope verwendet, mit reflektierenden Leuchten, die an einen speziell konfigurierten hinteren Anschluss angeschlossen sind. Die Apertur und die Feldlichtpendenz sowie der neutrale Dichtefilter gelangen in der Nähe des Anschlusses auf der Rückseite des Mikroskops ein. In einigen Umkehrmikroskopmodellen (nicht gezeigt) können L-förmige reflektierende Lichtbeleuchtung mit einer abseitsbaren Membran verwendet werden, um den Zugang zu den hinteren Zusatzanschlüssen für zusätzliches Zubehör zu verbessern. Der Lichtweg durch das Mikroskop in Abbildung 10 ist gelb für durchlässiges Licht, lila für ungefilterte Lichtlichtbeleuchtung, grün für die fluoreszierende Anregung des Filters und rot für die fluoreszierende Emission.

Moderne Umkehrmikroskoprahmen sind, wie ihre vertikalen Gegenstücke, von Computern entwickelte und hergestellte Verbundwerkstoffe für Struktur und thermische Stabilität. Darüber hinaus sind mechanische Plattformteile und Schaltungsstrukturen mit kurzen Strecken und hoher Steifigkeit konzipiert, um Neigungen und Ablenkungen bei der Manipulation des Objektivlenkers bei herkömmlichen Operationen wie z. B. DIC-Prisma-Einsatz oder Einstellung des Objektivkorrekturrings zu vermeiden. Die fortgeschrittene Objektiv-Drehscheibe-Phase ermöglicht es, den Fokus-Drift bei Verzögerungen und längeren Fluoreszenzbeobachtungen praktisch zu beseitigen. Weitere Bühnenoptionen, die nicht im Standard-Vertikalmikroskop verfügbar sind, umfassen Gleit- und 360-Grad-Drehbahnen, Glasbühnenplatten, Heizplatten, Petrischalen und Plattenhalter sowie Kohlendioxidkasten.

Das umgekehrte Mikroskop mit modularem Design kann einfach für die Forschung in der Elektrophysiologie, in vitro-Befruchtung, Mikromanipulation, hochauflösender DIC, videoverbesserter Beobachtung und einer Vielzahl von fortschrittlichen Fluoreszenztechnologien konfiguriert werden. Diese Instrumente sind auch leicht für Kofokuss- und Multiphotonmikroskope geeignet. Zu elektrischem Zubehör gehören Jalousien, Filterräder, drehbare Objektivscheiben, fluoreszierende Blockscheiben, Fokussantriebe und Fokusspiegel. In Kombination mit fortgeschrittenen Objektiven mit hohen Arbeitsabständen, Wassereintauchung, UV-Stimulation und Phasenkontrast, die alle eine hohe optische Korrektur aufweisen, ist das umgekehrte Mikroskop das ideale Instrument für die Fluoreszenzforschung lebender Zellen und Gewebe.

Schlussfolgerungen

Im Fluoreszenzmikroskop wirken sich die weiten Variationen zwischen den lokalen Fluoreszenzkonzentrationen innerhalb der Probe, zusammen mit den Differenzen in den Dämpfungskoeffizienten und der Quantenproduktivität von einem Fluoreszenzfarbstoff zu einem anderen, erheblich auf die Emissionssignale, die auf eine bestimmte Menge der Stimulationsintensität erzeugt werden. Angesichts der Tatsache, dass viele Proben nur Spuren von Fluoreszenzmaterialien in einem bestimmten Sichtfeld enthalten, erzeugen diese Kombinationsfaktoren durchschnittliche Fluoreszenz-Emissionen, die vier bis sechs Größengruppen kleiner sind als die Stimulationsintensität. Darüber hinaus gibt es einige komplexere Fluoreszenztechnologien wie in situ-Hybridisierung und Resonanz-Energietransfer (FRET), bei denen die Emissionssignalintensität um 9 bis 10 Größengruppen kleiner sein kann als die Intensität des stimulierten Emissionssignals. Um diese großen Unterschiede zwischen der Stimulationsintensität und der Emissionsintensität zu kompensieren, muss ein modernes Fluoreszenzmikroskop in der Lage sein, die Stimulationsbestrahlung mehr als eine Milliarde Mal zu dämpfen, ohne das Fluoreszenzsignal zu stören.

Eines der Hauptmerkmale des Fluoreszenzmikroskops ist die hohe Spezifizität der Fluoreszenzsonde, die Licht absorbiert und emittiert, was dazu führt, dass die Technik Objektivarten in komplexen Mischungen in sehr niedrigen Konzentrationen selektiv erkennen kann. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Empfindlichkeit und räumliche Auflösung der Fluoreszenz die genaue Positionierung und Untersuchung einzelner Moleküle auf einer Längenskala unter der optischen Auflösung des Mikroskops. Lokale Umweltfaktoren beeinflussen auch die Fluoreszenz-Emission erheblich, so dass die Methode eine ideale Sonde für pH-Wert, Viskosität, Ionenkonzentration, molekulare Entfernung und Orientierung, Membranpotenzial, Hydrophobie, Ladungsverteilung und Diffusionskoeffizienten ist. Die zeitliche Auflösung der Fluoreszenz ist auf die Lebensdauer der angeregten Fluoreszenzsonde begrenzt, die in der Größe von Nanosekunden sein kann. Da viele biologische Prozesse in dieser Zeitreihe stattfinden, kann die Zerfalldynamik dynamische Informationen über zelluläre Prozesse offenbaren. Insgesamt sind diese Faktoren entscheidend für die Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie in der Zellbiologie.

In den letzten zehn Jahren hat sich das Fluoreszenzmikroskop mit erstaunlicher Geschwindigkeit entwickelt und hat sich gleichzeitig ebenso schnell in den Bereichen Lasertechnologie, Feststoffdetektoren, Interferenzfilmherstellung und computerbasierte Bildanalyse entwickelt. Die Entwicklung von Wasserimmersionsobjektiven mit hoher numerischer Apertur fördert die Forschung biologischer Phänomene weiter und ermöglicht es Forschern, lebende Zellen in ihrer natürlichen Umgebung zu erkennen. Da Mikroskopfersteller auf die sich ändernden Bedürfnisse der Forschungsgemeinschaft reagieren, wird sich die Entwicklung fortschrittlicher Fluoreszenzinstrumente und -zubehör zweifellos weiter entwickeln, deren letzter Beitrag zur Erkundung der Mysterien der Natur vielleicht weitreichend sein wird.