Nukleensäuresynthesometer sind die Kernausrüstung der modernen molekularen Biologie, Genomik und biomedizinischen Forschung und Entwicklung und ermöglichen die effiziente und präzise Synthese bestimmter Sequenzen von DNA oder RNAoligonukleotiden (Oligonukleotide) in vitro.Seine technischen Prinzipien verbinden Festphasensynthesetechnologie, organische Chemie und präzise automatisierte Steuerung, um die „On-Demand-Schreibung“ des genetischen Codes des Lebens zu ermöglichen.

　　1. Kernprinzip: Chemische Methode von Festphasephosphatamiden

Die aktuelle Mainstream-Nukleinsäuresynthesetechnologie basiert auf dem Prinzip der Festphasensynthese, dessen Kern die Phosphat-Aminchemie ist. Diese Methode ist effizient, produktiv und einfach zu automatisieren und ersetzt frühere Phosphat-Diester- und Phosphat-Triester-Methoden. Der gesamte Syntheseprozess erfolgt in der Synthesespiele des Instruments, wobei die Syntheserichtung der Zielkette vom 3'-Ende bis zum 5'-Ende liegt.

Ein Zyklus der Synthese besteht hauptsächlich aus vier grundlegenden Schritten:

1. Entschützung:

Die Synthese beginnt mit der Kovalenzverbindung des ersten Nukleotids auf einem Festphasenträger. Das 5'-Hydroxy dieses Nukleotids wird durch eine geschützte Gruppe geschlossen. Der erste Schritt des Zyklus besteht darin, die synthetische Säule mit einer Säurelösung zu spülen, den DMT-Protektor am 5'-Ende des ersten Nukleotids zu entfernen und das aktive 5'-Hydroxy zu belichten, um die nächste Kupplungsreaktion vorzubereiten. Das entfernte DMT-Cation ist orange und kann die Syntheseeffizienz online durch Photometrie überwacht werden.

Aktivierung und Verbindungen:

Anschließend pumpt das Instrument das nächste zu verbindende Nukleotid-Monomer und das Aktivierungsmittel gleichzeitig in die Synthesekolone. Das Nukleotid-Monomer selbst ist hoch aktiviert, sein 3'-Ende ist durch Phosphat-Subaminogruppen geschützt, sein 5'-Ende ist durch DMT geschützt und hat auch eine entsprechende Schutzgruppe auf der Basis.

Der Aktivator aktiviert die 3'-Phosphat-Subamino-Gruppe des Nukleotid-Monomers, was es zu einem guten elektrophilen Reagenz macht. Anschließend reagiert es schnell nukleophil mit dem bereits ausgestellten 5'-Hydroxy auf dem Festphasenträger und bildet eine Phosphat-Triester-Bindung, wodurch ein neues Nukleotid der sich verlängerenden Oligonukleotidkette hinzugefügt wird.

3. Abdeckung:

Der gekoppelte Schritt ist nicht zu 100% wirksam und es gibt immer sehr wenige Ketten von 5'-Hydroxy, die nicht an der Reaktion beteiligt sind. Wenn diese fehlgeschlagenen Sequenzen nicht geschlossen werden, werden sie weiterhin in den nachfolgenden Zyklus an der Reaktion beteiligt und Nebenprodukte der fehlenden Sequenzen erzeugen.

Der "Kappen"-Schritt verwendet eine Mischung aus zwei Reagenzien, um das nicht reagierte 5'-Hydroxy zu acetylieren und es dauerhaft zu deaktivieren. Diese kurzen Ketten werden bei der endgültigen Reinigung entfernt, wodurch die Sequenzgerechtigkeit und Reinheit des Endprodukts erheblich verbessert werden.

4. Oxidation:

Die vorherige Kopplung bildet eine instabile Phosphat-Triester-Bindung, die leicht von Säuren abgebaut wird. Dieser Schritt führt in eine gemischte Lösung von Jod/Wasser/Pyridin und oxidiert sie zu einer stabileren Phosphat-Triester-Bindung, wodurch ein vollständiger Nukleotid-Zusatzzyklus abgeschlossen wird.

Danach wiederholt das Instrument automatisch die oben genannten vier Schritte "Entschützung → Kopplung → Kappe → Oxidation" und fügt jedem Zyklus ein neues Nukleotid hinzu, bis die gesamte Zielsequenz vollständig synthetisiert ist.

　　2. Nachsynthese

Nach der Montage der Kette des Nukleensäuresynthesators bleibt das resultierende Produkt ein DNA-Rohstoff, das an einem Festphasenträger verbunden ist und alle Gruppen geschützt sind. Daher sind Folgebehandlungen erforderlich:

1. Schneiden und Entschützen: Mit einer konzentrierten Ammoniaklösung wird einerseits die synthetische Oligonukleotidkette vom CPG-Träger abgeschnitten und andererseits alle Schutzgruppen auf der Basis und die DMT-Gruppe am Ende der Kette synchron entfernt.

2. Reinigung: Abhängig von den Anforderungen der Anwendung kann die Reinigung durch hocheffiziente Flüssigchromatografie (HPLC) oder Polyacrylamid-Gelelektrophoresis (PAGE) etc. durchgeführt werden, um Fehlerfolgen und Nebenprodukte zu entfernen und ein hochreines Endprodukt zu erhalten.

　　III. Zusammenfassung

Das Wesen eines Nukleensäuresynthesators ist ein hochautomatisierter Präzisionsreaktor für organische Chemie. Es ermöglicht eine schnelle, hohe Durchfluss- und präzise Synthese von DNA/RNAoligonukleotiden, indem komplexe synthetische chemische Reaktionen in eine Reihe von programmierbar gesteuerten standardisierten Schritten aufgebaut werden und die Flüssigkeitsströmung, die Reagenzdosis und die Reaktionszeit vom Computer genau gesteuert werden. Die Reife und Verbreitung dieser Technologie haben die schnelle Entwicklung von Spitzentechnologien wie Genbearbeitung, PCR-Tests, Nukleinsäure-Medikamente und DNA-Speicher stark gefördert.