In den Detektionssystemen von Aminosäureanalysatoren ist die Nachsäulen-Derivation ein entscheidender Schritt bei der Umwandlung von Aminosäuren nach der Isolierung durch die Chromatografie-Säulen in Derivate, die mit hoher Empfindlichkeit detektiert werden können, während die Fluoreszenzdetektion ein zentrales Mittel für die quantitative Analyse von Aminosäuren ist, indem das Fluoreszenzsignal des Derivats erfasst wird. Die Kombination von beiden kann das Problem der "freien Aminosäuren selbst Fluoreszenzsignale schwach, schwierig, direkt hochempfindliche Erkennung" lösen, ist die Mainstream-Technologie der modernen Aminosäureanalyse (insbesondere Spuranalyse), deren Prinzip kann in den "Reaktionsmechanismus der Ableitung nach der Säule" und das "Prinzip der Fluoreszenzdetektion der Optik" aufgebaut werden, wie folgt:
1. Das Prinzip der Ableitung nach der Säule: "schwer nachweisbare Aminosäuren" in "leicht nachweisbare Derivate" umwandeln
Aminosäuremolekule (mit Ausnahme von Triamin) haben an sich keine starken UV-Absorptions- oder fluoreszierenden Emissionsgruppen und eine sehr geringe Empfindlichkeit bei der direkten Detektion (nicht in der Lage, die Anforderungen der Spuranalyse auf μg/L-Ebene zu erfüllen). Die Kernlogik der Ableitung nach der Säule besteht darin, dass die Aminosäuren, die durch die Ionenaustauschchromatografie-Säule (das häufig verwendete Trennungsmodus der Aminosäureanalyse) getrennt wurden, nach der Ableitung der Säule mit einem bestimmten "abgeleiteten Reagenz" chemisch reagieren, um stabile Derivate mit starker Fluoreszenz (oder starker UV-Absorption) zu erzeugen, die Bedingungen für eine nachfolgende hochempfindliche Detektion schaffen.
1. Kernprozess: Trennung → Mischung → Reaktion → Detektion
Das Ableitungssystem nach der Kolonne besteht aus "Ableitungsreaktionsspeicherbehältern, Mischern, Reaktionsschalten, Temperaturregelgeräten" und umfasst folgende Schritte:
Aminosäure-Trennung: mehrere Aminosäuren in der Probe werden durch eine Ionenaustauschsäule (wie ein Sulfonat-Basis-Ionenaustauschharz) getrennt, die aufgrund der Differenzen in der Affinität zwischen verschiedenen Aminosäuren und Harzen in einer bestimmten Reihenfolge aus der Säule fließt;
Reagenzmischung: Der isolierte Aminosäurestrom (Flussphase + Aminosäure) wird mit abgeleiteten Reagensströmen (wie Triton, Phthaldiformaldehyde OPA, 9-Methylchloroformat FMOC) durch einen "T-Mischer" vollständig vermischt;
Thermostatische Reaktion: Die Mischung gelangt in den "Temperaturreaktionsbehälter" (in der Regel 30-130 ° C, je nach Reagenz), die bei einer bestimmten Temperatur eine abgeleitete Reaktion auftritt und fluoreszierende Derivate erzeugt;
Eingangsprüfung: Die Derivate nach der Reaktion fließen direkt in den Fluoreszenzdetektor, um das Signal zu erfassen.
II. Prinzip der Fluoreszenzdetektion: Erfassung des Fluoreszenzsignals von Derivaten und quantitative Analyse
Die Fluoreszenzdetektion basiert auf dem Phänomen der "photogenischen Emission": Wenn ein Fluoreszenzderivat durch Licht mit einer bestimmten Wellenlänge (excitiertes Licht) ausgesetzt wird, springen die Elektronen in einem Molekül die absorbierte Energie auf ein hohes Energieniveau und setzen anschließend einen Teil der Energie durch einen nicht-strahlenden Sprung frei, dann springen sie zurück zum Grundzustand und emittieren Licht mit einer bestimmten Wellenlänge (Fluoreszenz). Der Fluoreszenzdetektor verwandelt die Fluoreszenzintensität in ein elektrisches Signal durch "Stimulation der Lichtfilterung, Fluoreszenzsammelung und Signalwandlung", um letztlich eine quantitative Analyse der Aminosäuren zu erreichen.
1. Kernstruktur und Arbeitsablauf des Fluoreszenzdetektors
Der Fluoreszenzdetektor besteht hauptsächlich aus "Lichtquelle, Stimulationsmonofarber, Probenpool, Emissionsmonofarber, Photoelektromultiplikator (PMT), Signalprozessor", wie folgt:
Stimulierendes Licht: Zusammengesetztes Licht, das von einer Lichtquelle (häufig verwendete Xenonlampen, die ein kontinuierliches Spektrum von 200-800 nm liefern) emittiert wird, wird durch einen "Stimulierenden Monochrom" (bestehend aus Rastern und Schlitzen) gefiltert und behält nur das Monochrom, das mit der "Stimulierenden Wellenlänge" des Derivats übereinstimmt (wie OPA-Derivate, die 340 nm Stimulierendes Licht entsprechen);
Fluoreszenz-Anregung und Emission: Anregung des Lichts durch den Probenpool (durch die nach der Säule abgeleitete Derivatlösung fließt), das Derivatmolekül emittiert Fluoreszenz, nachdem es Energie absorbiert hat (Fluoreszenzirichtung vertikal mit dem angeregten Licht, um Lichtstörungen zu vermeiden);
Fluoreszenzfiltration und -sammlung: Die emittierte Fluoreszenz wird durch den Emissionsmonitor gefiltert (Entfernung von strahlendem Licht und nicht absorbiertem stimulierendem Licht), wobei nur das Monochromlicht beibehalten wird, das mit der Emissionswellenlänge des Derivats übereinstimmt (z. B. OPA-Derivate entsprechen 450nm emittierendem Licht);
Signalwandlung und Quantifizierung: Die gefilterte Fluoreszenz wird von der "Photoelectric Multiplier Tube (PMT)" empfangen, die schwache optische Signale in ein proportionales elektrisches Signal (Strom oder Spannung) umwandelt und dann durch den Signalprozessor verstärkt und nach der modularen Umwandlung ein Chromatogramm der "Fluoreszenzintensität - Retentionszeit" erzeugt.
Quantitative Grundlage: Gemäß der "Fluoreszenzverlängerungsform des Lambert-Bill-Gesetzes" - in einem bestimmten Konzentrationsbereich ist die Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzderivats proportional zur Aminosäurekonzentration, und die Konzentration der einzelnen Aminosäuren in der Probe kann durch den Vergleich der "Fluoreszenzintensität des Standard-Aminosäurederivats (Standardkurve)" mit der "Fluoreszenzintensität des Probenderivats" berechnet werden.
2. Hauptvorteile der Fluoreszenzdetektion: hohe Empfindlichkeit und hohe Spezifizität
Im Vergleich zur UV-Absorptionsdetektion hat die Fluoreszenzdetektion einen unersetzlichen Vorteil in der Aminosäureanalyse, was auch der Kerngrund ist, warum die Post-Column-Derivation oft mit der Fluoreszenzdetektion verbunden wird:
Hohe Empfindlichkeit: Die Detektionsgrenze (LOD) der Fluoreszenzdetektion kann nmol / L oder sogar pmol / L erreichen (1-3 Größengruppen niedriger als die UV-Detektion), um Spuren von Aminosäuren in biologischen Proben (z. B. Blut, Urin) zu erkennen (z. B. erhöhte Spuren von Aminosäuren durch metabolische Anomalien);
Hohe Spezifizität: kann nur "fluoreszierende Derivate" detektieren, während die Flussphase, Verunreinigungen (wenn sie nicht mit abgeleiteten Reagenzien reagieren) fast kein fluoreszierendes Signal haben, um die Spitzeninterferenzen effektiv zu vermeiden (z. B. Aminosäureanalyse nach Proteinhydrolyse in Lebensmitteln, ohne Komplexität vor der Behandlung der Entmischung);
Breiter linearer Bereich: Im Konzentrationsbereich 104-105 ist die Fluoreszenzintensität in einem guten linearen Verhältnis zur Aminosäurekonzentration und eignet sich für die Quantifizierung von Proben mit unterschiedlichem Gehalt (von Spuren bis zu Konstanten).
Synergische Logik der Ableitung nach der Säule und der Fluoreszenzdetektion (warum muss sie kombiniert werden?)
Die Kombination beider löst perfekt den Schmerzpunkt der "Trennung-Detektion" der Aminosäurenerkennung und bildet einen geschlossenen Kreislauf:
Ableitung nach der Trennung, um Störungen zu vermeiden: Ableitung nach der Säule erfolgt nach der Trennung der Aminosäuren durch die Chromatografie-Säule, das abgeleitete Reagenz reagiert nicht mit Verunreinigungen in der Probe (wie Proteine, Salze) (Verunreinigungen wurden von der Chromatografie-Säule getrennt oder keine Aminosäuren enthalten), um "Ableitung von Verunreinigungen zu vermeiden" (Ableitung vor der Säule kann eine Spitzenauflüge verursachen, die durch die gemeinsame Entfernung von Derivaten und Verunreinigungen verursacht werden);
Fluoreszenz nach der Ableitung, erhöhte Empfindlichkeit: Durch die Ableitung von "fluoreszenzfreien Aminosäuren" in "starke fluoreszenzende Derivate" umwandeln, so dass die Fluoreszenzdetektion schwache Signale erfassen und die Anforderungen der Spuranalyse erfüllen kann (z. B. Präzision des Aminosäurenmetabolischen Spektrums in der klinischen Diagnose);
Das Signal ist mit der Konzentration verbunden, um die Quantifizierung zu erreichen: Die Fluoreszenz-Intensität ist proportional zur Derivatkonzentration (d. h. der Konzentration der Primäraminosäuren), die Kombination mit der Standardkurve kann den jeweiligen Aminosäuregehalt genau bestimmen, und das Ergebnis ist gut wiederholbar (RSD ist in der Regel < 2%).