I. Einführung in das Bichi Hefe Expressionssystem

Pichia pastoris-Expressionssystem Als ein hocheffizientes Eukarien-Expressionssystem hat das Pichia pastoris-Expressionssystem ein breites Anwendungsbereich und erhebliche Vorteile. Im Vergleich zu anderen Expressionssystemen sind die Vorteile des Bich Hefe Expressionssystems offensichtlich. Es verfügt über einen derzeit starken, streng regulierten Promotor, den Alkoholoxidase-Gen AOX1-Promotor, der eine präzisere und effizientere Regulierung der Expression von exotischen Genen ermöglicht. Sein hohes Expressionsniveau kann sowohl die intrazelluläre Expression als auch die sekretorische Expression erreichen und die Bedürfnisse verschiedener Forschung und Produktion stark erfüllen. Der Fermentationsprozess ist ausgereift und leicht zu vergrößern, hat bereits die Fähigkeit zur industriellen hohen Dichteproduktion in großem Maßstab und bietet die Voraussetzungen für die Entwicklung der Industrialisierung. Die Kultivkosten sind niedrig, das Produkt ist leicht zu trennen, das verwendete Fermentationsmedium ist billig und enthält kein Protein, was die Trennung der nachgelagerten Produkte fördert und die Produktionskosten reduziert. Das exogene Protein-Gen ist genetisch stabil und kann nach der Integration in das Bichi-Hefe-Chromosom mit der Chromosomenkopierung stabil vorhanden sein und nicht leicht verloren gehen. Darüber hinaus hat die Bichi-Hefe als Eukarien-Expressionssystem auch die subzelluläre Struktur des Eukarien-Organismus, die in der Lage ist, das ausgedrückte Protein durch Glykoxylierung, Fettasylierung, Proteinphosphorylation und andere Translationsmodifikationen zu verarbeiten, so dass das ausgedrückte Protein strukturell und funktionell näher an das natürliche Protein steht und eine höhere biologische Aktivität hat.

II. Zusammensetzung des Bichi-Hefe-Expressionssystems

1. Wirt Bakterien

Derzeit für die Expression von exogenen Proteinen verwendete Hefe-Gastbakterien sind: Die meisten Gastbakterien wie Mut + Methanol-Typen GS115, X-33, SMD1165, SMD1163 und SMD1168; MutS Methanol mit langsamer Form KM71; Mut-Methanol nicht verwendet Typ MC100-3. Siehe die nachstehende Tabelle, in der die unterschiedlichen Expressionshosterbakterien und Expressionsmerkmale der Bich-Hefe im Detail aufgeführt sind.

Tabelle 1 Häufige Bich Hefe Expression Host Bakterien und Merkmale

Stämme	Merkmal
GS115	Mit hoher Expression, hoher Zelldichte und hoher löslicher Proteinproduktion, die derzeit weit verbreitet werden
der KM71	Methanol mit langsamer Form, geeignet für den Ausdruck schwer löslicher Proteine
X33	Verbessert die Expression und Aktivität, geeignet für die Expression von recombinanten Proteinen
SMD1168H	Bessere Expressionseffizienz und höhere Zelldichte für die Expression von Makromolekularen
SMD116 (his4 pep4)	Der Protease-fehlende Stamm ist in der Lage, den Proteinabbau zu reduzieren und die ungleichmäßige Verteilung der Expressionsprodukte aufgrund des Proteinabbaus zu lösen, obwohl der Stamm relativ langsam wachsen kann, was zu einer geringeren Produktion von ausgedrückten exotischen Proteinen führen kann.
Der Y-11430	Effiziente Ausdrucksfähigkeit mit regulierbarem Ausdruck

2. Träger

Bich-Hefe-Expressionsträger sind hauptsächlich integrierte Träger, die üblichen Träger können in intrazelluläre Expressionsträger und sekretäre Expressionsträger unterteilt werden.

Tabelle 2 Häufige Bich Hefe Expression Host Carriers und Merkmale

3. Bichi-Hefe-Fermentationsprozess

1. Die Fermentationsphase

Die Fermentation von Bicchi-Hefe ist in der Regel in zwei Phasen unterteilt: 1, Zellwachstumsphase: Zunächst in der Wachstumsphase, die in einem Kultivmedium mit Kohlenstoffquellen wie Glycerin oder Glukose durchgeführt wird, sammelt sich ausreichende Zelldichte und Biomasse, wenn die Bakterienkonzentration eine bestimmte Phase erreicht, wenn Glycerin oder Glukose erschöpft ist, führt dies zu einem plötzlichen Anstieg des gelösten Sauerstoffs auf etwa 100%, dann beginnt Glycerin oder Glukoselösung zu fließen und die Belüftungs- und Rührergeschwindigkeit aufrechtzuerhalten, um den gelösten Sauerstoffspiegel bei etwa 30% aufrechtzuerhalten, um die Biomasse (Bakterienkonzentration) weiter zu erhöhen. 2. Induktionsphase: Wenn die Biomasse die Anforderungen erfüllt hat, hört die Kohlenstoffquelle auf, die Kohlenstoffquelle ist erschöpft, und nach dem Ende der Übergangsphase wird die Kohlenstoffquelle auf Methanol gewechselt, um die Fermentationsphase des Zielproteins zu induzieren. In der Regel wird 0,3% Methanol zweimal induziert und dann beginnt die Methanol-induzierte Proteinexpression auf diese Weise, die die Expression von exogenen Proteinen erhöht und es der Bichet-Hefe ermöglicht, hohe Konzentrationen von Zielproteinen in kürzerer Zeit zu sammeln.

Die induzierte Expressionsphase ist ein entscheidender Bestandteil der Fermentationsproduktion von Bich-Hefe, in der Methanol als spezifischer Induktor als Ersatz für frühere Kohlenstoffquellen verwendet wird. Die Alkoholoxidase-Gene in der Bichet-Hefe (wie AOX1) werden in Anwesenheit von Methanol aktiviert, wodurch eine effiziente Expression von exotischen Genen angetrieben wird. Die Bedingungskontrolle in dieser Phase hat einen wichtigen Einfluss auf die Produktion und Qualität von exotischen Proteinen und erfordert eine strikte Kontrolle der Menge an Methanol, der Zusatzrate und der Temperatur, dem pH-Wert und der Menge an gelöstem Sauerstoff in der Fermentationsumgebung, um sicherzustellen, dass exotische Gene kontinuierlich und effizient ausgedrückt werden können und gleichzeitig die Toxizität von Methanol und andere nachteilige Auswirkungen auf die Zellen vermeiden.

2. Arten und Rezepte von Fermentationsmedien

Die Vielfalt der Bich-Hefe-Fermentationsmedien ist vielfältig, und verschiedene Mediumsformeln eignen sich für verschiedene Fermentationsphasen und -zwecke.

Das BSM-Medium (Basissalz) ist eines der am häufigsten verwendeten Basismedien für die Fermentation von Bicher Hefe, dessen typische Formel lautet: 85% Phosphorsäure 26,7 ml/l, Calcium-Dihydratsulfat 0,93 g/l, Kaliumsulfat 18,2 g/l, Magnesium-Hephatosulfat 14,9 g/l, Kaliumhydroxid 4,13 g/l, Glycerin 40,0 g/l, PTM1 4,35 ml/l. Dieses Medium liefert die grundlegenden Nährstoffe für das Wachstum der Hefe, einschließlich anorganischer Salze wie Stickstoff, Phosphor, Kalium und Magnesium sowie Glycerin als Kohlenstoffquelle, während PTM1 Nährstoffe wie Spurenelemente und Vitamine ergänzt, die für das Wachstum der Hefe erforderlich sind, um das normale Wachstum und den Stoffwechsel der Hefe aufrechtzuerhalten.

Das F22-Medium ist auch ein gängiges Hefenfermentationsmedium, dessen Formulierung in verschiedenen Forschungs- und Produktionsanwendungen angepasst werden kann, aber in der Regel eine angemessene Menge an Kohlenstoffquellen (wie Glukose oder Glycerin), Stickstoffquellen (wie Hefenextrakt, Protein, etc.), anorganische Salze (wie Magnesiumsulfat, Calciumchlorid, Kaliumdihydrogenphosphat usw.) und andere Zusatzstoffe (wie Biotin, Spurenelementlösungen usw.) enthält. Im Vergleich zu BSM-Medien kann das F22-Medium in Bezug auf die Zusammensetzung und das Verhältnis der Nährstoffe optimiert sein, um spezifische Fermentationsanforderungen zu erfüllen, z. B. in einigen Fällen besser zur Verbesserung der Expression von exotischen Proteinen oder zur Verbesserung der Qualität von Proteinen.

Neben den oben genannten beiden gängigen Medien gibt es viele andere Bich-Hefe-Fermentationsmedien, deren Rezepturen oft auf spezifische experimentelle Zwecke, Stammeigenschaften und Anforderungen des Fermentationsprozesses optimiert und angepasst werden. In einigen Studien werden zum Beispiel spezielle Inhaltsstoffe wie Aminosäuren, organische Säuren, Polyzucker usw. in das Kulturmedium hinzugefügt, um die Effizienz der Verwendung bestimmter Substrate durch Bichhefe zu verbessern oder ihre Toleranz gegenüber Umweltdruck zu verbessern; Oder durch die Anpassung des Anteils an Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen im Medium, um das Wachstum und den Stoffwechsel der Hefe-Zellen zu optimieren, um eine höhere Fermentationseffizienz und Produktausbeute zu erzielen.

3. Fermentationsprozessparameter

Bei der Fermentation spielt die genaue Kontrolle der Prozessparameter, einschließlich pH, Temperatur, gelöstem Sauerstoff, eine entscheidende Rolle für den Erfolg der Fermentation, die miteinander verknüpft sind und einander beeinflussen und gemeinsam den Wachstumszustand, die Stoffwechselaktivität und den Ausdruck von exogenen Proteinen bestimmen.

Der pH-Wert ist einer der Schlüsselfaktoren, die die Fermentation von Bich Hefe beeinflussen. Die Anforderungen an den pH-Wert variieren in verschiedenen Wachstumsphasen und Stoffwechselprozessen. In der Phase des Zellwachstums ist der allgemein geeignete pH-Bereich 5,0 - 6,0, unter diesen pH-Bedingungen können Hefe-Zellen einen guten Wachstumszustand aufrechterhalten, und die Aktivität des Enzyms kann auch besser gespielt werden, was die Zellverpflanzung und die Akkumulation von Stoffwechselprodukten fördert. Der pH-Wert beeinflusst nicht nur den Wachstumszustand der Bakterien während der Fermentation der Bichhefe, sondern auch die Expression von exotischen Proteinen. Die Auswirkungen des pH-Wertes auf die Bichheife umfassen hauptsächlich die folgenden Aspekte: (1) beeinflussen die Aktivität der Enzyme in der Zelle und beeinflussen somit den Stoffwechsel der Zelle, wodurch die Expression von exotischen Proteinen auch beeinflusst wird; (2) beeinflusst die Durchlässigkeit der Zellmembran und hat einen gewissen Einfluss auf die Aufnahme von Nährstoffen und die Ausscheidung von Stoffwechselprodukten durch die Zellen; (3) Der pH-Wert beeinflusst die Auflösung der Komponenten im Medium und der Stoffwechselprodukte der Zelle, was die Aufnahme von Nährstoffen durch die Zelle beeinflusst; (4) Der pH-Wert kann auch den Stoffwechselprozess der Zelle beeinflussen, so dass sich der Gehalt der Zellmetabolide ändert. Außerdem sollte der pH-Wert der Protease-Wirkung vermieden werden, um den Abbau von exotischen Proteinen durch Protease im Prozess der hohen Fermentationsdichte zu verringern, und der pH-Wert wird an einem elektrischen Punkt wie dem exotischen Protein abgeweicht und auch die Ernte von exotischen Proteinen verbessert.

Temperatur: Es hat auch einen signifikanten Einfluss auf das Wachstum und den Stoffwechsel der Bichhefe. Die Wachstumstemperatur der Bichi-Hefe ist in der Regel zwischen 28 und 30 ° C geeignet. In diesem Temperaturbereich wachsen die Hefe-Zellen schneller und haben eine starke Stoffwechselaktivität, die in der Lage ist, die Nährstoffe im Kulturmedium effizient zu nutzen, um zu wachsen und sich zu vermehren. Allerdings kann eine zu hohe Temperatur über 32 ° C zu einem Zelltod führen, da hohe Temperaturen die Stabilität von Biomolekülen wie Membranstrukturen, Proteine und Nukleensäuren der Zelle stören und so die normale physiologische Funktion der Zelle beeinträchtigen. Im Gegensatz dazu verlangsamt sich das Wachstum der Zellen bei niedrigeren Temperaturen, aber einige Studien zeigen, dass eine angemessene Reduzierung der Kultivtemperatur die Produktion und Qualität des Zielproteins verbessern kann. Dies liegt daran, dass eine niedrige Temperatur den Stress der Proteinfaltung in der Zelle reduzieren kann, das Auftreten von Fehlfaltungen reduzieren kann, aber auch die Aktivität der Protease reduzieren und den Grad der Hydrolyse von exotischen Proteinen reduzieren kann, was die korrekte Faltung und Akkumulation von exotischen Proteinen fördert.

Lössener Sauerstoff (DO): Ein weiterer entscheidender Prozessparameter bei der Fermentation von Bichhefen. Bei der Verwendung von Glycerin und Methanol für das Wachstum und den Stoffwechsel benötigt die Bicherhefe Sauerstoff, daher ist die Aufrechterhaltung eines geeigneten Gehalts an gelöstem Sauerstoff von entscheidender Bedeutung, um eine reibungslose Fermentation sicherzustellen. Während des gesamten Fermentationsprozesses muss die Konzentration von gelöstem Sauerstoff normalerweise auf einem Niveau von > 20% gehalten werden. In den frühen Phasen des Zellwachstums ist der Sauerstoffbedarf aufgrund der geringen Anzahl von Bakterien relativ gering, und zu diesem Zeitpunkt kann der gelöste Sauerstoffbedarf der Zelle durch richtige Belüftung und Rühren erfüllt werden. Mit zunehmendem Zellwachstum und verstärkter Stoffwechselaktivität steigt der Sauerstoffverbrauch allmählich, und es ist notwendig, die Luftmenge, die Rührgeschwindigkeit oder die reine Sauerstoffergänzung weiter anzupassen, um den gelösten Sauerstoffspiegel zu erhöhen, um sicherzustellen, dass die Zellen ausreichend Sauerstoff für den Stoffwechsel erhalten können. Wenn Sauerstoffmangel auflöst wird, kann dies zu einem langsamen Zellwachstum, einer verringerten Akkumulation von Stoffwechselprodukten und sogar zum Zelltod führen, was die Effizienz der Fermentation und den Ertrag des Produkts ernsthaft beeinträchtigt.

Kulturzeit: ist einer der entscheidendsten Faktoren für die Erreichung der höchsten Proteinexpression im Bich-Hefe-Expressionssystem, wobei die Produktionszeit im Bich-Hefe-Expressionssystem relativ lang ist (ca. 100 h). Die Kulturzeit hängt von der Anzahl der Hefe-Zellen und dem Abbau des Zielproteins ab. Studien haben gezeigt, dass die höchste Wachstumsdichte von Pasterbich-Hefe-Zellen eine Kultur von 96 h ist, während die höchste Proteinexpression in 48 h auftritt [11], was darauf hindeutet, dass eine längere Kulturzeit wahrscheinlich dazu führt, dass das ausgedrückte Protein verdaut wird, und es gibt andere Studien, die zeigen, dass die beste Proteinexpressionszeit in einer Kultur von 72 bis 96 h auftritt [2]

Der Fermentationsprozess ist ein komplexer und feiner Prozess, der eine präzise Kontrolle und Optimierung der Fermentationsphase, der Mediumsformel und der Prozessparameter erfordert. Die Fermentationsbedingungen wie pH, Temperatur, gelöster Sauerstoff und die Zusammensetzung des Mediums können systematisch durch die Methode des Experimentalen Entwurfs (DOE) optimiert werden, um die Vorteile der Beech-Hefe zu nutzen und eine effiziente Expression und Produktion von exotischen Proteinen zu erreichen. Durch ein tiefes Verständnis der Fermentationseigenschaften und Bedürfnisse von Bicchi-Hefe und die kontinuierliche Optimierung des Fermentationsprozesses durch die Kombination von fortschrittlichen Fermentationstechnologien und -ausrüstungen wird die Effizienz und Produktqualität der Bicchi-Hefe weiter verbessert.

4. Die „stille Zusammenarbeit“ von Bichi-Hefe und Gärbehältern

Beim Fermentierungsprozess der Bicherhefe bietet der Fermentierbank als Kernausrüstung die entscheidenden Umweltbedingungen für das Wachstum und den Stoffwechsel der Bicherhefe, um sicherzustellen, dass sie ausländische Proteine effizient ausdrücken kann.

Die Fermentationsbehälter sorgen durch ein präzises Temperaturkontrollsystem für eine geeignete Wachstumstemperatur für die Bicherhefe. Wie bereits erwähnt, können die spezifischen Anforderungen an die Temperatur in der Wachstumsphase von 28 - 30 ° C und in der induzierten Expressionsphase bei der Beech-Hefe die Temperaturregelung des Fermentationsbehälters genau in diesen eingestellten Temperaturbereichen gehalten werden, um nachteilige Auswirkungen von zu hohen oder zu niedrigen Temperaturen auf das Hefe-Zellwachstum und die Proteinexpression zu vermeiden. Diese präzise Temperaturregelung ist besonders wichtig bei der Massenfermentation, da sie sicherstellt, dass jede Partie von Bicchi-Hefe bei einer stabilen und geeigneten Temperatur wachsen kann, was die Stabilität und Wiederholbarkeit der Produktion erhöht.

Zur Regelung des pH-Wertes sind Fermentationsbehälter mit fortschrittlichen pH-Mess- und Regelgeräten ausgestattet. Abhängig von den unterschiedlichen Bedürfnissen an pH-Werten in den verschiedenen Phasen der Beech-Hefe-Fermentation können Fermentationsbehälter automatisch eine Säure-Alkali-Lösung hinzufügen, um den pH-Wert genau im gewünschten Bereich zu halten. Durch die Aufrechterhaltung des pH-Werts von 5,0 bis 6,0 während der Zellwachstumsphase und die Anpassung der induzierten Expressionsphase auf 3,0 bis 5,0 hilft diese präzise pH-Kontrolle, die Aktivität der Enzyme in Hefe-Zellen aufrechtzuerhalten, das normale Zellwachstum und den Stoffwechsel zu fördern, während der Abbau von exotischen Proteinen reduziert und die Produktion und Qualität von Proteinen verbessert wird.

Die Kontrolle des gelösten Sauerstoffspiegels ist auch eine der Schlüsselfunktionen eines Fermentationstanks. Der Bedarf an gelöstem Sauerstoff während der Fermentation ist hoch, und der Fermentationstank sorgt durch ein vernünftiges Belüftungssystem und eine Rühreinrichtung dafür, dass die Konzentration von gelöstem Sauerstoff immer auf einem Niveau von > 20% bleibt. Das Belüftungssystem kann gleichmäßig Luft oder Sauerstoff in die Fermentationsflüssigkeit zuführen, während die Rühreinrichtung durch ständiges Rühren den Sauerstoff in der Fermentationsflüssigkeit vollständig verteilt, die Effizienz der Sauerstoffübertragung verbessert, den Sauerstoffbedarf der Bich-Hefe in verschiedenen Wachstumsphasen erfüllt, um die normale Durchführung ihrer Stoffwechselaktivität zu gewährleisten und somit den effizienten Ausdruck von exotischen Proteinen zu fördern.

Die Synergie der Rührer- und Belüftungssysteme gewährleistet auch eine gleichmäßige Verteilung der Nährstoffe in der Fermentationsflüssigkeit und verhindert einen lokalen Nährstoffmangel oder -überschuss, so dass jede Bichet-Hefe-Zelle in einer guten Ernährungsumgebung wachsen kann. Gleichzeitig ist die Dichtungsleistung des Fermentationsbehälters auch sehr wichtig, es kann die Verschmutzung durch äußere Bakterien verhindern, die Reinheit und Stabilität des Fermentationsprozesses von Bichi-Hefe sicherstellen und Probleme wie Fermentationsfehler oder Produktqualitätsverlust vermeiden.

Jin Wei Bio Fermentationstank Produkte basieren auf diesen kritischen Anforderungen entworfen und hergestellt, verfügen über eine fortschrittliche Temperaturregelung, pH-Regelung, Sauerstofflösung und ein effizientes Rühren- und Belüftungssystem, um optimale Umweltbedingungen für die Fermentation von Bichi-Hefe bereitzustellen, um den Benutzern zu helfen, eine effiziente und stabile Fermentationsproduktion von Bichi-Hefe zu erreichen, sei es in der kleinen Testphase im Labor oder in der industriellen Massenproduktion. Wir werden uns weiterhin auf die Forschungsdynamik und die Anwendungsbedarf von Beech Hefe konzentrieren, kontinuierlich das Design und die Fertigungstechnologie von Fermentationsbehältern optimieren und innovieren, die Leistung und Stabilität von Fermentationsbehältern verbessern und die Fermentationsproduktion von Beech Hefe fortschrittlicher und effizienter unterstützen, um gemeinsam die Biotechnologie-Industrie in eine glänzendere Zukunft zu fördern.

Jin Wei Bio Fermentationstank Einführung
Jimway-be ® Lab-Serie ------ Desktop-Reaktoren

Jimway-be ® PM-Serie ------ Mehrfachbioreaktoren

Anwendung: Kultivierung und Fermentation und Expression von Protokern-/Eukaryozellen

Petri-Schalen Volumen: 250ml / 500ml / 1L / 3L / 5L / 10L

Anzahl der Einheiten: 2-16

Kultivierungsmethode: Aufhängen & Kleben

Rudertyp: Drei- und Sechsblatt, Sechsblatt, Halbrohr, Hebeprod und vielfältige Kombinationen

Antriebsart: Magnetkopplungsantrieb / mechanische Rührung

Steuerungsstrategie: PID & Treppensteuerungsstrategie (Zusatzstoffe, Rührgeschwindigkeit, Temperatur, Belüftung usw.)

Ergänzungssteuerung: Präzise Ergänzungssteuerung (±1g Fehler)

Funktionen:

Einfache Schnittstelle: Nur ein paar Minuten zu beherrschen, die Arbeit doppelt so viel

Unbewahrt: Fernzugriff, Bedienung und Unbewahrtheit

Rezeptfunktion: Rezept mit einem Klick, Verringerung der Bedienungsfehler und Verbesserung der Qualität

Datenanalyse: Multi-Batch-Datenvergleich oder externe Doe&PAT-Analyse mit mehreren Variablen zur Optimierung der Prozessdaten

Datenaustausch: VPN-basierte Web-Veröffentlichung zur Überwachung und Anzeige der Verlaufskurve auf mobilen Endgeräten (Android, IOS, Windows) unter Gewährleistung der Datensicherheit und der Gerätesicherheit