Das RolR-Protein stammt von Bacillus glutamatus und gehört zur TetR-Familie der Abwehrproteine. In der Natur funktioniert es eindeutig: Durch die Identifizierung und Kombination von "Interphenolen" (Chemikalien, die weit verbreitet in der industriellen Produktion verwendet werden), reguliert es die Genexpression von Bakterien und hilft Bakterien, mit Interphenolen in der Umwelt umzugehen und Schäden zu vermeiden.

Diese „Einzigartigkeit“ ist sowohl ein Vorteil als auch eine Einschränkung in der Wissenschaft. Die Wissenschaftler haben erkannt, dass RolR mehr Moleküle „lernen“ kann, um kostengünstige, hochempfindliche Biosensoren für die Umweltüberwachung (z. B. die Erkennung schädlicher Aromastoffe in Industrieabwässern), die Arzneimittelsynthese (Echtzeitüberwachung der Konzentrationen von Arzneimittelzwischenstoffen) und sogar die Krankheitsdiagnostik (Erkennung krankheitsbezogener molekularer Marker) zu entwickeln.

Um RolR neue Fähigkeiten zu ermöglichen, nutzten die Forscher die Technik der „Orientierten Evolution“, um den natürlichen Evolutionsprozess zu simulieren und die Funktionsoptimierung in drei Schlüsselstufen zu beschleunigen:

RolR identifiziert das Interphenol des Substrats mittels einer "Ligand-Bindungstasche", deren Form und Aminosäurekomposition die Art der Moleküle bestimmen, die sie binden können. Die Forscher untersuchten 19 wichtige Aminosäuren, die sich in der Tasche oder in der Nähe befanden. Genaue Mutationen dieser Aminosäuren wurden durch die Techniken "Combined Active Site Saturation Test (CAST)" und "Iterative Saturation Mutation (ISM)" durchgeführt, um eine große Menge an RolR-Varianten zu erzeugen (Abbildung 1.A-C). Es ist bemerkenswert, dass die Forscher absichtlich die Aminosäure D149 behielten, den „Schlüsselhalter“ für die Erkennung von Interphenolen durch RolR, deren Mutation zu einem vollständigen Funktionsverlust führen könnte.

Nur wenige der mutierten Bibliotheken erfüllen gleichzeitig zwei Bedingungen: sowohl eine normale Bindung an DNA-regulierende Gene (die Grundfunktion gewährleisten) als auch eine „Aktivierung“ durch neue Zielmoleküle (die neue Funktion erhalten). Die Forscher entwarfen ein "Dual-Choice" -System mit TetA-Antiporter-Protein (Abbildung 1D, Abbildung 2):

Diese Screening-Methode kann effektiv "unzulässige" Varianten beseitigen und letztendlich einen qualitativ hochwertigen Kandidaten mit "voll funktionierenden + neuen molekularen Reaktionen" hinterlassen.

Das Forscherteam hat sich nicht auf die erste Generation der Varianten beschränkt. Sie setzten die Mutationsoptimierung fort, indem sie Varianten für die Erkennung von Katecholen als Vorlage benutzten und schließlich eine RolR-Variante erhielten, die sechs neue Moleküle erkennte, darunter:

Der Nutzen eines Biosensors hängt weitgehend davon ab, ob er in verschiedenen Gastgebern funktionieren kann. Das Team "transplantierte" die modifizierte RolR-Variante in eine Weinhefe, ein häufig verwendetes Modell für Eukarien (Abbildung 3), und fand heraus:

Auf der Oberfläche der Ergebnisse ist der modifizierte RolR spezienübergreifend anwendbar und bildet die Grundlage für seine Anwendung in Eukarien, wie die metabolische Überwachung in Hefe-Zellfabriken.

Von der einzigartigen Identifizierung von Interphenolen bis hin zu einer Vielseitigkeit, die Moleküle unterscheidet, zeigt die Transformation von RolR den zentralen Charme der synthetischen Biologie – durch die präzise Manipulation von Biomolekülen, die dem Leben neue Funktionen verleihen und praktische Probleme lösen, denen der Mensch gegenübersteht. Dieses orientierte Evolutionsrahmen ist nicht nur für RolR geeignet, sondern kann auch auf andere aTF- und Ligand-bindende Proteine ausgeweitet werden, was die Tür für die Entwicklung von "maßgeschneiderten" Biosensoren eröffnet. Vielleicht werden diese kleinen Proteinsensoren in naher Zukunft in unser Leben eintreten und als „unsichtbare Wächter“ für Umwelt, Gesundheit und industrielle Produktion dienen.