Obwohl die früheren Screening-Strategien der Autoren zur Identifizierung von humanen Gen-Alternativen in Hefe-Genen erfolgreich waren, war diese Strategie mühsam und identifizierte nur zwei Inhibitoren (Kachroo et al., 2015). Die Technik erfordert die künstliche Trennung der Kolonien und dann durchgeführtViertelDie Isolierung und Identifizierung von Inhibitoren erfordert das künstliche Screening von Hunderten von Hefekolonien. Daher entwickelten die Autoren ein neues Verfahren zur automatisierten Screening von Inhibitor-Subplasmiden auf eine hohe Durchsatzart (Abbildung 1a).

Die Autoren konzentrieren sich insbesondere auf das Screening von Inhibitormutationen im nicht komplementären menschlichen β2c-Protein (HsPSMB7), einer Proteasomal-Untereinheit mit kompositorischer Expression. Diese Methode ermöglicht ein großes und fehlerfreies Screening in deutlich verkürzter Zeit. Das Experiment wurde in Form von 96-Loch-Platten durchgeführt und durch synthetische genetische Arrays (SGAoder die MM-Selektion zur Isolierung von monopoly-spezifischen Mutanten, so dass keine Quadrat-Isolierung erforderlich ist (Pan et al., 2004; Kuzmin et al., 2016). Durch die Bestimmung der Plasmid-Abhängigkeit mit 5-FOA ausgewählt wurde bestätigt, dass Komplementarität mit Variationen in menschlichen Genen auf der URA3-basierten Plasmid assoziiert ist. Mit dieser Strategie haben die Autoren erfolgreich mehrere ersetzbare hemmende Mutationen im HsPSMB7-Gen erhalten. Während der gesamten Arbeit verwendeten die Autoren immer die Begriffe "funktionale Ersatz", "Ersatzbarkeit" oder "Ersatzfähigkeit", um sich auf die Fähigkeit des menschlichen Gens oder seiner Varianten zu beziehen, die Funktion seiner Hefe-Homogene zu kompensieren. Der Screening-Prozess wurde auf der Grundlage mehrerer Überlegungen entwickelt. Das wilde menschliche PSMB7 (β2c) kann das homogene Hefe-β2-Gen ScPUP1 nicht ersetzen, was durch die tödlichen Phänotype, die bei der selektiven Entfernung des Hefe-Gens beobachtet wurden, nachgewiesen werden kann (Abbildung 1b, Ergänzung Abbildung 1b) (Cahero et al., 2015). Im Gegensatz dazu, wenn ein menschliches Gen (oder seine Varianten) erfolgreich die Funktion des Wirtsgens ersetzt, wird der Stamm in der Lage sein, zu wachsen und somit als einfacher Detektionsindikator für eine funktionelle Alternative zu dienen. Eine PCR-Strategie mit einer höheren Fehlerrate generierte eine HsPSMB7-Mutationsgenbank in Hefe-Expressionsverträgern mit URA3-Markierungen mit durchschnittlich 1 bis 4 Mutationen pro Gen (Abbildung 1a).

Um festzustellen, ob ein mutiertes PSMB7-Allel die Todeligkeit ausgleichen kann, die durch die Entfernung des homogenen Hefe-Gens verursacht wurde, konvertierten die Autoren die Mutationsgenbank in den Hefe-Haploden HetKO PUP1/pup1Δ::kanMX-Stamm (Pan et al., 2004). Das Transformationsprogramm wurde erweitert, um Tausende von voneinander isolierten Hefekolonien zu erhalten, die jeweils ein anderes PSMB7-mutiertes Plasmid tragen (Abbildung 1b). Mit dem QPix 460 wurden Tausende von Kolonien automatisiert ausgewählt und im 96-Loch-Format in ein präsporiertes GNA-Medium eingeimpft.G418Die Selektionsmethode filtert pup1Δ mit dem kanMX-Tag. Nach der Sporenbildung konnten in MM-Medien (ohne Leu, Arg, His, Ura und CAN) überlebbare pup1Δ::kanMX-Hefesporen ausgewählt werden, die verschiedene menschliche PSMB7-Allelen tragen (in Anwesenheit von G418) (Abbildung 1c, untere Platte). Als interner Kontroll für die Effizienz der Sporenbildung testeten die Autoren auch das Wachstum der wildtypischen PUP1-Monosporen auf MM-Medien (ohne G418) (Abbildung 1c, obere Tabelle). Die Screenergebnisse zeigten, dass 19 Kolonien (repräsentatives Bild in Abbildung 1d), die auf MM + G418-Medium wachsen, eine komplementäre menschliche PSMB7-Variante tragen könnten. Anschließend wurden diese monopoly-hemmenden Mutanten getestet, um festzustellen, ob die Unterdrückung auf menschliche Mutationen in Plasmoiden zurückzuführen ist. Die Plasmodiabhängigkeit von Hefe-Zellen wurde auf der Grundlage eines Mangels an Wachstum an 5-FOA (das das URA3-Gen hemmt) getestet. Sieben dieser 19 hemmenden Mutanten konnten auf 5-FOA-Medien nicht überleben, was darauf hindeutet, dass menschliche Genvarianten in diesen Stämmen für ihr Überleben erforderlich sind (Abbildung 1d).

Idealerweise würde die Humanisierung von Hefen, um menschliche Gene funktional zu charakterisieren, die wildtypischen menschlichen Allelen in Hefen nutzen. Inhibitor-Screening und c-End-Schwanz-Austausch-Daten zeigen jedoch, dass menschliche β2c Mutationen benötigen, um mit benachbarten Hefe-Untereinheiten, insbesondere Scβ3, zu interagieren, um richtig in Hefe CP zusammengesetzt zu werden. Daher können Strategien zur Wiederherstellung dieser menschlichen spezifischen Untereinheitsinteraktionen die Integration des wilden Typs HsPSMB7 in Hefe-Proteasomen ermöglichen. Um diese Hypothese zu bestätigen, fragten die Autoren, ob der wildtyp menschliche β2c die Hefe-Kollegen in den Stämmen funktional ersetzen könnte. Die Autoren haben einen CRISPR-Cas9-basierten Ansatz entwickelt, um die Hefe-Gene ScPUP1 (β2) und ScPUP3 (β3) anzugreifen. Plasmid-Transformationshefe, die Cas9-sgRNAScPUP1 oder Cas9-sgRNAScPUP3 ausdrücken, führen zu ihrem Tod. Wenn menschliche Gene Hefe funktional ersetzen könnenHomogene GeneDann werden menschliche Gene Reparatur Schablonen, die die entsprechenden Hefe-Standorte 5' und 3' End-Homogene Sequenzen enthalten, zur Co-Transformation und wird erwartet, dass überlebende Zellen erhalten.

Die Autoren haben zunächst getestet, ob der wilde Typ HsPSMB7 ScPUP1 ersetzen kann, um in situ zu funktionieren, aber keine überlebenden Kolonien zu erhalten, wie erwartet (Abbildung 2a). Mit HsPSMB7-Varianten mit T44A- oder S214G-Mutationen ermöglicht die Reparaturvorlage jedoch den funktionellen Ersatz des Hefe-PUP1-Gens (Abbildung 2b). Zuvor haben die Autoren gezeigt, dass das Hefe-Beta-3-Gen (PUP3) funktional durch sein humanes Homogene (HsPSMB3) ersetzt werden kann, wenn es auf Plasmoiden ausgedrückt wird (Kachroo et al., 2015). Mit einer HDR-basierten CRISPR-Cas9-Strategie (Achmetov et al., 2018) ersetzten die Autoren erfolgreich das β3-Gen der analysierten Hefe durch ein menschliches β3-Gen (HsPSMB3) (Abbildung 2c). Daher kann die β2-Untereinheit der Hefe die menschliche β3-Untereinheit in den Hefe-Proteasom-Kern rekrutieren, aber die menschliche β2c-Untereinheit kann diese Rolle nicht gemeinsam mit der β3-Untereinheit der Hefe spielen. Mit zunächst dem humanen β3-Hefstamm kann die CRISPR-Cas9-basierte Genbearbeitungstechnik nun das β2-Hefe durch das wildtypische menschliche β2c-Gen (HsPSMB7) ersetzen. Doppelte Hsβ2c-Hsβ3 Hefe Stämme sind überlebbar, dies durch platzspezifische PCR undSanger-SequenzierungEs wurde überprüft (Abbildung 2d).

Durch die Bereitstellung seiner benachbarten menschlichen Untereinheit, dem menschlichen β3, ist das normalerweise nicht komplementäre menschliche β2c nun in der Lage, eine Rolle im Hefe-Proteasom zu spielen. Die Bereitstellung von humanem β3 in Hefe ermöglicht jedoch nicht, dass Hefe β2 durch Hsβ2i komplementär wird. Quantitative Wachstumsmessungen zeigten einen moderaten Anpassungsfehler der ingenieurlichen Stämme. Humanisierte Hsβ2c-S214G-Stämme zeigten bei 23 °C eine kryotempfindliche Wachstumsfehler, während die humanisierten Hsβ2c-T44A-Stämme langsamer wachsen als die wilden Stämme bei 23 °C und 37 °C. Darüber hinaus, während die humanisierten Hsβ3-Stämme vergleichbar mit dem wilden Hefenwachstum sind, zeigen die humanisierten Hsβ2c-Hsβ3-Stämme bei 23 ° C einen empfindlichen Phänotyp und wachsen langsamer bei 30 ° C in flüssigen Kulturen.