Einführung
Einzellige RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ist eine Technik zur abweichenlosen Charakterisierung der Genexpression in komplexen Zellen und Gewebeproben. Obwohl scRNA-seq chedi die moderne Biologie verändert hat, ist es technisch immer noch herausfordernd und oft teuer. Die Lösungen, die derzeit auf dem Markt sind, ermöglichen eine effektive Analyse einer kleinen Anzahl von Zellen bei einem ursprünglichen Pool von Zehntausenden von Zellen. Allerdings fehlt ein vereinfachtes Schema für die Vorbereitung der Bibliothek von scRNA-seq für die Behandlung seltener Zellpopulationen. Hier haben wir ein neues Lochplattentest für kostengünstige und hochempfindliche scRNA-Seq entwickelt. Dieser Workflow unterstützt die Bibliotheksvorbereitung von seltenen Proben aus seltenen Zellpopulationen. In diesem neuen Workflow (Abbildung 1) haben wir DispenCell und spezielle Prüfkopf (SEED Biosciences, Schweiz) mit einem speziellen und optimierten Single Cell Library Preparation System (MERCURIUS High Sensitivity BRB-seq Kit, Alithea Genomics， Schweiz).
Einzelzellverteilung
Vor der Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek haben wir zunächst die Fähigkeit von DispenCell getestet, einzelne Zellen in einem speziellen Lysenpuffer zu verteilen. Die Lymphozytenlinie wird aus einer gefrorenen Flasche aufgefroren, zweimal übertragen und dann in einer einzelligen Suspension geerntet. Filtern Sie die Zellen mit einem 10 μm Zellfilter (Miltenyi Biotec, Deutschland), zählen und verdünnen Sie sie in einer Methylcellulose-Verteilungslösung ohne RNAse (DispenMe, SEED Biosciences) auf eine Endkonzentration von 2 x 104 Zellen/ml. Dann laden Sie 200 Zellen aus der Zellsuspension mit DispenCell Sensor Saugkopf. Setzen Sie DispenCell für die Zuweisung von Einzelzellen auf 384-Loch-Platten mit 4,2 μL Lysatpuffer (HS BRB seq Kit, Alithea Genomics) vorgeladen. Die ersten 96 Löcher verteilen etwa 7 Minuten. Dann stoppen Sie die Zuordnung, da wir genügend Proben für die nachgelagerte Analyse haben.
Einzellige Qualitätskontrolle
Sofort nach der Zuordnung verwenden wir die von SEED Biosciences entwickelte Software DispenSoft für die Einzelzellqualitätskontrolle. Jedes Loch in der Bohrplatte ist in einer farbkodierten Matrix dargestellt (Abbildung 2.a). Wenn das Loch eine einzelne Zelle enthält, kennzeichnet die Software sie grün, während das rote Loch null oder mehrere Zellen enthält und sollte verworfen werden. Um Fragmente und Zellen zu unterscheiden, wird eine Schwelle festgelegt, indem Sie ein größenbasiertes Histogramm steuern (Abbildung 2.b). Nur Spitzen über der Schwelle zählen als Zellen.
Hier erhielten wir 77 Einzelzell-Löcher (80% Einzelzell-Isolationsrate). Mit DispenSoft können auch Rohimpedanzdaten für die Aufzeichnung von Prozessen verwendet werden. Jede Impedanzkurve kann manuell überprüft werden. Ein einzelner Spitze ist ein Merkmal einer einzelnen Zelle (Abbildung 2.c), während mehrere Zellen produzieren mehrere Spitzen. Dies deutet darauf hin, dass DispenCell in der Lage ist, Dosierzellen in einem Lysenpuffer in einem einfachen, schnellen und wanquant nachverfolgbaren Prozess zu verteilen.