Einführung
3D-Biodruck wird als funktionale 3D-Strukturen oder künstliche Gewebemodelle von Zellen und biokompatiblen Materialien definiert. 1 Diese Technologie hat das Gebiet des Tissue Engineering verändert und es ermöglicht, komplexe, vordefinierte Strukturen zu erstellen, während die Wiederholbarkeit gewährleistet ist. Mehrere auf 3D-Biodruck basierende Methoden wurden für die Entwicklung verschiedener Gewebe wie Knorpel, Knochen und Hautregeneration berichtet. Diese Technik wurde auch verwendet, um neue präklinische Tumormodelle zu erstellen. Tatsächlich, als 2D-Zellkultur-Modelle aufgrund des Mangels an Vorhersagbarkeit zunehmend in Frage gestellt werden, hat sich 3D-Biodruck zu einer alternativen Methode entwickelt, um dieses Problem zu umgehen, indem es verschiedene Zellen und extrazelluläre Matrix-Derivate, Modellierung / Demonstration der Tumor-Mikroumgebung (TME) verarbeitet. Viele auf 3D-Biodruck basierende Tumormodelle umfassen Lungenkrebs, Brustkrebs und Glioblastoma. 7 Diese Modelle zeigen Vorteile im Design, Flexibilität und Wiederholbarkeit im Vergleich zu anderen Strategien wie Zellkugeln und Organoide. Eierstockkrebs ist ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit, und 3D-Biodruck wird immer noch als Modell für Eierstockkrebs untersucht. Bei solchen Tumortypen wurde gezeigt, dass die Krebsassoziierten Fibrozellen (CAF) eng mit den Krebszellen interagieren und eine Hauptrolle bei der Krebsinvasion und der Medikamentressistenz spielen. 8,9 CAFs sind daher der Schlüssel zur Gestaltung von Eierstockkrebsmodellen.
Vorteile
High-Content-Screening und Instant Transfection helfen, 3D-Biodruck-Experimente zu charakterisieren und zu validieren • Instant Genexpression ist ein leistungsstarkes Werkzeug, um die Vielseitigkeit von 3D-Biodruck-Modellen zu erhöhen • Multi-Wellenlänge-Analysewerkzeuge sind notwendig, um die Leistungsfähigkeit von 3D-Biodruck-Modellen zu nutzen, um die Interaktionen verschiedener Zelltyp-Gruppen innerhalb des Modells zu untersuchen In dieser Anwendungsanweisung wird 3D-Biodruck verwendet, um Eierstockkrebsmodelle zu erstellen, die Krebszellen (SKOV3-Zellen) und CAF-Fibrozellen (MeWo-Zellen) enthalten. Transfektieren Sie SKOV3-Zellen mit jetOPTIMUS (Polyplus) GFP-Plasmoden und färben Sie MeWo-Zellen mit CellTracker und Orange CMRA Dye (ThermoFisher). Beide Zelltypen sind in Gelatin - Alginat - auf Hydrogel-Basis enthalten, um eine zylindrische tumorähnliche Struktur zu erhalten, die zur Bildung verwendet wird. Die Homophasität des Modells und die Wiederholbarkeit der Zellverteilung innerhalb dieser Tumoren wurden mit ImageXpress Pico bewertet.
Ergebnisse und Diskussionen
Wie in Abbildung 1 gezeigt, zeigt die Bioprint-Strukturbildgebung eine homogene Verteilung von SKOV3-Zellen, die GFP und fluoreszierende Färbung MeWo Zellen auf Gelatin-Alginat-Matrix (Abbildungen 1A und B) ausdrücken. Dies ist sehr wichtig, da homogene Zellverteilung gleichmäßig verteilt in Biotinte ein wichtiger Faktor ist, der beim 3D-Druck berücksichtigt werden muss 12 Darüber hinaus ist natürliche TME bekannt, dass es eine Vielzahl von Zelltypen enthält, die eng interagieren. 13 Daher ist es wichtig, dies zu reproduzieren und gleichzeitig in vitro-Tumormodelle aufzubauen, um die Wechselwirkungen zwischen Krebs und Matrixzellen zu fördern.
Während mehrere Zelltypen in Tumoren kombiniert werden sollten, um die TME-Heterogenität besser zu simulieren, müssen die Anzahl und der Anteil der einzelnen Zelltypen kontrolliert werden, um die Wiederholbarkeit zu gewährleisten. ImageXpress Pico eignet sich besonders für diese Art von Steuerung, da es schnell und einfach mehrere Mikroskopbilder aufnehmen kann. Die Software CellReporterXpress ermöglicht die Quantifizierung mehrerer Zellen, auch in dicken Proben, mit der maximalen Projektion des Z-Stacks. In dieser Anwendungsbeschreibung zeigt dieses System zur Analyse unserer biogedruckten Tumormodelle eine gute Wiederholbarkeit in Bezug auf Zellzahl und Verhältnis in sechs biogedruckten Strukturen mit einer durchschnittlichen Anzahl von SKOV3-Zellen (Zellzahl FITC) von 837 ± 200 (Standardabweichung ≤ 25%). Für MeWo-Zellen (Zellzahl TRITC) betrug die durchschnittliche Anzahl 3264,50 ± 462 (StD ≤ 15%).

Abbildung 1 Analyse der 3D-Bioprinter Struktur CMRA Farbstoff von SKOV3-Zellen mit transfizierten GFP-Plasmoden und MeWO-Zellen mit CellTracker Orange gefärbt. A) FITC- und TRITC-Bilder von 3D-Biodruckstrukturen in Loch B3, die mit dem ImageXpress Pico-System (4X, Z-Stack) erfasst wurden. B) Analyse der Masken der FITC- und TRITC-Zellzahl, die mit der CellReporterXpress-Software erstellt wurden. C) Die durchschnittliche Anzahl der Zellen in den FITC- und TRITC-Kanälen (5 Löcher, Färbung und Transfektion) und der negativen Kontrolle (3 Löcher, unfärbt und unfärbt) der Probe. D) Beurteilung der Transfektionseffizienz mit GFP Plasmid und jetOPTIMUS-Polyplus-Transfektion-Transfektion Kit (FITC-positive Zellen Prozentsatz / TRITC-positive Zellen).

Materialien und Methoden
Hydrogel-Vorbereitung
Für die Hydrogel-Zubereitung, die gewünschte Qualität der Gelatine und Natrium-Alginat-Pulver gewogen, unter UV-Strahlung für 1 Stunde, dann gelöst in Dulbecco verbessert EagleMedium mit Lowest Essential Medium (MEM) gemischt, ergänzt mit 10% fetales Rinderseru. Die erhaltene Lösung wird dann über Nacht bei 37 ° C unter magnetischer Rührer gehalten und homogenisiert. Transfektion und Färbung von SKOV3-Zellen mit jetOPTIMUS (Polyplus) GFP-Plasmoden gemäß Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, eine angemessene Menge an DNA wird auf den jetOPTIMUS-Puffer verdünnt und das jetOPTIMUS-Transfektionsreagens entsprechend hinzugefügt. Die Transfektionslösung wird 10 Minuten bei Raumtemperatur gelagert und dann zu den kultivierten SKOV3-Zellen hinzugefügt, die in einer T75-Flasche mit einer Fusionsrate von 60-80% kultiviert werden. Verwenden Sie den CellTracker Orange CMRA-Farbstoff (ThermoFisher), um MeWO-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu färben. 11 Kurz gesagt, die Arbeitslösung wird in DMSO gelöst und dann in MEM-Medium verdünnt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 30 Minuten. Entfernen Sie die Reagenzlösung und ersetzen Sie sie durch frische.fertigKulturmedium.

Abbildung 2 Abbildung der Methoden für den Biodruck und die Bildgebung der Modellstruktur von Eierstockkrebs.