Einer,Ultrafiltrierte ZentrifugerrohreOptimierung der Zentrifugalparameter
Geschwindigkeit und Zeit
Die erste Zentrifuge wird empfohlen, mit 70% der empfohlenen Drehzahl zu beginnen (z. B. 3000 × g Zentrifuge für 10 Minuten), nach Beobachtung der Durchflussgeschwindigkeit schrittweise auf 4000 × g anzupassen, aber nicht die Grenze der Filterfilm-Toleranz zu überschreiten.
Die typische Bearbeitungszeit beträgt 10-30 Minuten, abhängig von der Retention Molecular Weight (MWCO) und dem Probenvolumen.
Temperaturregelung
Die Zentrifuge muss auf 4 ° C vorgekühlt werden, um die Adsorption von Wärmedeformation zu verringern. Eine niedrige Temperatur kann die Lebensdauer der Membrane verlängern, aber beachten Sie, dass die Konzentrationszeit verlängert werden kann.
Beschleunigung und Gleichgewicht
Die Zentrifugenbeschleunigung wird auf den niedrigsten Gang eingestellt, um den Druck auf die Membran zu verringern.
Stellen Sie sicher, dass die gepaarte Ultrafilterrohrqualität im Schwerpunkt ausgewogen ist und dass die Position und Richtung des Filterkörpers konsistent sind, um Schütteln oder Beschädigungen während des Zentrifugalprozesses zu vermeiden.
Strategie zur Erhöhung der Recyclingquote
Filterfolienwahl und Vorbehandlung
Wählen Sie eine MWCO-Ultrafilter, die 2-3 Mal kleiner als das Zielmolekül ist, je nach Zielmolekulangewicht. Wenn zum Beispiel das Zielproteinmolekulargewicht 35 kDa beträgt, wählen Sie ein Ultrafilter mit einem Molekulargewicht von 10 kDa.
Die Ultrafilter-Membrane der neu gekauften Ultrafiltrationszentrifugen enthalten Spuren von Glycerin, die vor der Verwendung in reinem Wasser oder Puffer eingeweicht und 10 Minuten im Kühlschrank gekühlt werden müssen. Anschließend gießen Sie reines Wasser aus und legen Sie das Ultrafilter für 2-5 Minuten auf Eis vor.
Probenbehandlung und Probenahme
Die Probe wird im Voraus mit einem 0,22 μm Filterfilm gefiltert, um zu vermeiden, dass Partikel die Ultrafilter verstopfen.
Fügen Sie die Probe langsam in das Ultrafilter hinzu, so dass die Flüssigkeitsfläche die maximale Markierungslinie nicht überschreitet. Bei der Probenaufnahme ist der Betrieb leicht, um die Beschädigung der Membranstruktur zu vermeiden.
Konzentration und Entfernung
Unterbrechen Sie alle 5 Minuten während der Zentrifugation und blasen Sie die Abdeckschicht sanft mit einer Pipette, um zu verhindern, dass sich große Moleküle aufbauen, um eine starke Differenzpolarisierungsschicht zu bilden.
Interruptionsvolumen wird auf 1/10 bis 1/20 der ursprünglichen Probenvolumen gesteuert. Zu hohe Konzentrationsmehrfache führen leicht zu einer Proteinangemessung, die durch die Zugabe von Puffern in der Mitte der Ultrafiltration ersetzt werden kann.
Bei klebrigen Proben (z. B. Glycerin oder Saccharose enthaltend) muss die Drehzahl um 10-20% reduziert und die Zentrifugierzeit verlängert werden.
Recyclingvorgänge
Nach der Zentrifugierung bleiben die großen Moleküle in der oberen Schicht, während kleine Moleküle und Lösungsmittel durch die Membran in die untere Schicht gelangen. Außenfilter sind kleine molekulare Substanzen und Lösungsmittel; Die innere Flüssigkeit besteht aus großen Molekülen.
Um die Massenmolekularmaterial zu sammeln, nehmen Sie ein anderes Rohr ab, und das Innere Rohr wird 1000 x g für 1-2 Minuten umgekehrt.
Häufige Fragen und Lösungen
Protein leckt oder nicht nachweisbar
Ursache: falsche Auswahl des Filterfilms, ungeeignete Zentrifugalparameter, zu niedrige Anfangskonzentration der Probe usw.
Lösung: Wählen Sie den passenden MWCO-Filter erneut aus und passen Sie die Zentrifugalparameter an, um sicherzustellen, dass die Anfangskonzentration der Probe größer als 25 μg/ml ist.
Membran verstopft oder zu langsam
Ursache: zu viel Partikel in der Probe, Filterfilm Verschmutzung usw.
Lösung: Die Probe wird im Voraus gefiltert und die Filterfolie regelmäßig gereinigt oder ausgetauscht. Wenn Sie feststellen, dass die Membran verstopft ist, einweichen Sie 1 Stunde mit 0,1 M NaOH und spülen Sie dreimal mit reinem Wasser.
Niedrige Recyclingquote
Ursache: Adsorptivität des Filterfilms, falscher Betrieb usw.
Lösung: Schließen Sie den Filterfilm 30 Minuten im Voraus mit 1% BSA, um die nicht spezifische Adsorption zu verringern. Seien Sie beim Betrieb vorsichtig und vermeiden Sie die Beschädigung der Membranstruktur.
Abfälle nach Ultrafiltration
Ursache: zu hohe Proteinkonzentration, ungeeigneter Puffer usw.
Lösung: Mit mehreren Ultrafilterrohren gleichzeitig ultrafiltrieren, um die Konzentration zu senken; Wechseln Sie einen anderen Puffer, bis das Protein nicht fällt. Für die Fällung kann nach Auflösung mit 8M Harnstoff erneut zentrifugiert werden.
4. Wartung und Wartung
Reinigung und Desinfektion
Einmal verwendete Ultrafilterzentrifuge, die direkt nach der Verwendung weggeworfen wird.
Zur Wiederverwendung werden die fertigen Ultrafilterrohre fünfmal wiederholt mit reinem Wasser gereinigt, anschließend 1-2 Stunden mit 0,1 M NaOH eingeweicht, anschließend mit 20% Ethanol gereinigt und dreimal mit ultrareinem Wasser oder Puffer gereinigt. Die Wiederverwendung von Ultrafilterrohren ist in der Regel nicht empfohlen, mehr als fünfmal.
Langfristige Aufbewahrung
Kurzfristige Aufbewahrung: 1-2 Stunden mit 0,1 M NaOH einweichen, dreimal mit reinem Wasser waschen und dann mit 75% Ethanol einweichen, achten Sie darauf, dass der Filterfilm feucht bleibt und keine Bakterien wächst.
Langfristige Aufbewahrung: 1-2 Stunden mit 0,1 M NaOH einweichen, dreimal reines Wasser waschen und dann mit 20% Ethanol einweichen, achten Sie darauf, dass der Filterfilm feucht bleibt und keine Bakterien wächst.