Die Tests von Proteinen mit Quantitationsanalysern für Nukleensäuren in Ultra-Spuren (z. B. Ultra-Spuren-Nukleensäure-Proteinmeter) basieren hauptsächlich auf der UV-sichtbaren Spektrophotometrie, bei der die Konzentration eines Proteins durch Messung der Absorption bei bestimmten Wellenlängen (z. B. 280 nm) geschätzt wird. Hier sind die spezifischen Methoden und wichtigen Schritte zum Testen von Proteinen:
1. Prüfprinzip
Trp, Tyr und Cys-Cys-Dischwefelbindungen in Proteinmolekülen werden bei 280 nm Wellenlängen deutlich absorbiert. Das Instrument berechnet direkt die Proteinkonzentration (mg/ml) durch Messung der Absorption einer Proteinlösung bei 280 nm (A280) in Kombination mit dem Lambert-Biers-Gesetz. Diese Methode erfordert keine Standardkurven, aber stellt sicher, dass die Probe keine anderen Verunreinigungen enthält, die bei 280 nm stark absorbiert werden (z. B. Nukleinsäuren, Phenole).
II. Betriebsschritte
Geräte vorbereitet
Anschließen Sie die Stromversorgung, starten Sie das Instrument und erhitzen Sie es für 5-10 Minuten in den stabilen Zustand.
Wählen Sie den Detektionsmodus "Protein A280" aus und setzen Sie den Lichtbereich ein (normalerweise 10 mm, das Instrument kann sich jedoch automatisch anpassen).
Zero-Punkt-Kalibrierung mit hochreinem Destillationswasser oder leerem Puffer, um Hintergrundstörungen zu beseitigen.
Probenbehandlung
Probenvolumen: Es wird empfohlen, 2 μL Proben zu verwenden (einige Instrumente unterstützen 0,5-2 μL Spurenerkennung), um die Bildung einer stabilen Flüssigkeitssäule zu gewährleisten.
Vermeiden Sie Blasen: Berühren Sie beim Probieren die Unterseite des Messlochs und freisetzen Sie langsam die Flüssigkeit, um zu verhindern, dass Blasen die Absorptionsmessung beeinflussen.
Oberflächenspannung: Wenn die Oberflächenspannung der Probe niedrig ist (z. B. Entverschmutzung enthält), kann die Probenvolumen auf 4 μL erhöht werden, um die Stabilität der Flüssigkeitssäule zu gewährleisten.
Leere Kontrolle
Nehmen Sie 2 μL leere Lösung (z. B. Puffer) und fügen Sie die untere Basis hinzu, legen Sie die obere Basis ab und klicken Sie auf die Schaltfläche "Leer", um die Hintergrundabsorption aufzuzeichnen.
Wischen Sie die Basis, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeitsreste vorhanden sind.
Probenprüfung
Nehmen Sie die 2 μL Probe auf die untere Basis, legen Sie die obere Basis ab und klicken Sie auf die Schaltfläche "Probe".
Das Gerät misst automatisch die Absorption und berechnet die Konzentration, wobei die Ergebnisse in der Regel in mg/ml angegeben werden.
Proben mit hoher Konzentration: Wenn der Absorptionswert den Messbereich des Instruments übersteigt (z. B. Lichtstärke < 200), muss die Probe nach Verdünnung erneut untersucht werden.
Datenaufzeichnung und Reinigung
Speichern Sie die Testergebnisse und exportieren sie als CSV oder PDF.
Die Basis mit einem staubfreien Tuch abwischen, um Kreuzverschmutzung zu vermeiden.
III. Wichtige Hinweise
Basis-Kalibrierung
Die Standardwellenlänge der Basis-Kalibrierung beträgt 340 nm und kann vom Benutzer nach Bedarf angepasst werden.
Die Kalibrierung muss vor der Probentests abgeschlossen werden, sonst werden die Spektralwerte verschoben und zu Konzentrationsberechnungsfehlern führen.
Reinheit der Probe
Vermeiden Sie Nukleinsäuren, Phenole oder hohe Konzentrationen von Salzonen in der Probe, die eine störende Absorption bei 280 nm verursachen können.
Für die Erkennung von Verunreinigungen können Sie eine Farbvergleichsmethode (z. B. BCA, Bradford) kombinieren oder den Hintergrund mit einer doppelten Wellenlänge (280 nm/340 nm) abziehen.
Wartung der Geräte
Lichtquelle: Vermeiden Sie eine lange Belichtung und schalten Sie die Lichtquelle aus, wenn sie nicht verwendet wird, um die Lebensdauer zu verlängern.
Monochromator: Ersatz von Trocknungsmitteln (z. B. Silikon) regelmäßig, um zu verhindern, dass die dispersen Elemente von Feuchtigkeit und Schimmel ausgesetzt werden.
Detektor: verhindert starkes Licht oder feuchtigen Staub und hält sauber.
Umgebung: Das Instrument sollte auf einem trockenen, stabilen Arbeitstisch platziert werden, fern von der Luftausgabe oder dem direkten Sonnenlicht, und die Temperatur sollte bei 25 ° C ± 2 ° C gesteuert werden.
Spezielle Probenbehandlung
Kondensierte Proben: Langsam geladen mit 45 Grad Schrägwand, um Überlauf oder Newtonring-Störungen zu verhindern.
Polyzuckerstoffe: Nach der Detektion müssen die Flüssigkeitswege mit Ethanolreagenz gespült werden, um Rückstände zu vermeiden.
Fettproben: Wenn das Auftauchen auftritt, müssen sie zuerst nach der Tieftemperaturzentrifugaltrennung getestet werden.
Anwendungsszenarien und Vorteile
Schnelle Dosierung: Keine komplizierte Vorbehandlung erforderlich, Tests innerhalb von 2-5 Minuten abgeschlossen, geeignet für hohe Durchfluss-Screening.
Spurenerkennung: Nur 0,5-2 μL Proben benötigt, um wertvolle Proben (z. B. klinische Proben, seltene Proteine) zu sparen.
Multiparametrische Analyse: Einige Geräte unterstützen die gleichzeitige Detektion von A260 (Nukleinsäure), A280 (Protein) und OD600 (Bakterienkonzentration), um die Quantifizierung mehrerer Komponenten zu erreichen.
Portabilität: Kompakte Konstruktion für Vor-Ort-Prüfungen oder mobile Labore.