[Behandlung von PCR]

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PCR (Polymerase-Kettenreaktion) und Gelelektrophoresis sind häufig in molekularbiologischen Forschungen eingesetzte Techniken, die häufig in Kombination zur Identifizierung und Analyse von PCR-amplifizierten Produkten verwendet werden. Bei der Durchführung der PCR-Gelelektrophorese werden jedoch häufig Mischgänge in den Elektrophorese-Karten gefunden, die die Ergebnisse des Experiments stören und sogar zum Fehler des Experiments führen können.

Dieser Artikel untersucht die Ursachen der Mischung während der PCR-Gelelektrophorese und bietet einige mögliche Lösungen.

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Optimierung der PCR-Bedingungen:Die Anpassung der PCR-Reaktionsbedingungen führt zu einer zu niedrigen Ausbrenntemperatur zu einer unspezifischen Bindung des Primärs an die Schablone, wodurch eine unspezifische Amplifikation ausgelöst wird; Eine übermäßig hohe Hitztemperatur kann die normale Kombination der Vorlage mit der Schablone unterdrücken und die Vergrößerungseffizienz beeinträchtigen. Die optimale Aushärtetemperatur kann schrittweise durch Gradienten-PCR-Experimente bestimmt werden. Im Allgemeinen liegt die Temperatur der Aushärterungsschritte einer PCR-Reaktion in der Regel zwischen 50 ° C und 68 ° C, abhängig von der Basissequenz des Primärs und den Eigenschaften der ZielDNA. Einige Primäre erfordern eine höhere Brütentemperatur, um eine spezifische Kombination in einem bestimmten Bereich zu gewährleisten, aber in der Regel wird die maximale Brütentemperatur nicht über 68 °C liegen.

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Unvernünftiges Design:Wenn ein Prelator zu kurz ist, sich die Sequenz wiederholt oder einen hohen GC-Bereich enthält, kann dies zu einer unspezifischen Bindung des Prelators mit der Schablone führen, die zu einer Mischung führt. Die Vorlage muss neu gestaltet werden, um sicherzustellen, dass die Länge der Vorlage angemessen ist, die Sequenz nicht sich wiederholt, der GC-Gehalt moderat ist und hohe GC-Bereiche innerhalb der Vorlage oder im Bereich der Kombination der Vorlage vermieden werden.

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Unsachgemäße Dosierung:Eine zu hohe oder unspezifische Primärdosis kann zu einer unspezifischen Verstärkung führen, die zu Mischgängen führt. Es wird empfohlen, die Vorläufer zu wechseln oder die Anzahl der Vorläufer zu reduzieren.

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Vorlage unrein:SchablonenDNA enthält Verunreinigungen wie Proteine, RNA oder andere nicht-ZielDNA-Fragmente, die als Schablone für PCR-Verstärkung dienen können, was zum Auftreten zusätzlicher Streifen führt.

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Vorlage Abbau:Die Vorlage-DNA wird während der Extraktion oder Lagerung abgebaut, und die entstehenden kleinen Stücke der DNA können Vorlagen für unspezifische Amplifikationen werden.

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Reinigung der DNA:Die Vorlage-DNA in einem PCR-Experiment kann aus einer Vielzahl von Quellen stammen, darunter genomische DNA (gDNA), komplementäre DNA (cDNA) und Plasmid-DNA. DNA aus verschiedenen Quellen kann jedoch in Zusammensetzung und Komplexität variieren, was die optimale Ausgangsmenge für PCR-Amplifikation beeinflussen kann. Zum Beispiel benötigt eine 50 µL PCR-Reaktion nur 0,1–1 ng Plasmid-DNA, während gDNA 5–50 ng benötigt. Darüber hinaus wirkt sich der verwendete Typ der DNA-Polymerase auf die optimale Vorlage-Startmenge aus. Die modifizierte DNA-Polymerase hat eine stärkere Affinität und Empfindlichkeit für die Schablone und somit eine relativ geringe Anfangsmenge an DNA. Die Optimierung des DNA-Startvolumens ist von entscheidender Bedeutung, da eine zu hohe Startmenge zu einem erhöhten Risiko für unspezifische Amplifikation führen kann, während eine zu niedrige Startmenge die PCR-Rate verringern kann. Manchmal verwendet das PCR-Experiment die Kopienzahl, um die Ausgangsmenge der DNA anzugeben, insbesondere für gDNA. Die Berechnung der Kopienzahl bezieht sich auf die Avogadro-Konstante und die Molmasse mit der Formel: Kopienzahl = L × Molanzahl = L × Gesamtmasse / Molmasse.

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Zu hohe Konzentration von Mg²:Mg²+ ist ein wichtiger Bestandteil der PCR-Reaktion, aber eine zu hohe Konzentration verringert die Spezifizität der PCR-Amplifikation und erhöht das Risiko einer nicht-spezifischen Amplifikation. Die optimale Konzentration von Mg²+ muss experimentell ermittelt werden.

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Schlechte Menge oder Qualität der Enzyme:Überdosierung oder schlechte Qualität des Enzyms beeinflussen die PCR-Reaktion. Es wird empfohlen, die Enzymdosis zu reduzieren oder das Enzym aus einer anderen Quelle zu ersetzen.

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Verwenden Sie thermische Start-PCR:Die thermisch initiierte PCR reduziert die nicht spezifische Amplifikation, die die Reaktion bei niedrigen Temperaturen verursachen kann.

Thermal-Initiated PCR ist eine Technik zur Reduzierung unspezifischer Amplifikation. Bei der konventionellen PCR kann der Prototyp bereits an die Vorlage-DNA gebunden sein, bevor die Reaktionstemperatur auf die Amplifikationstemperatur ansteigt. Dies kann zu einer unspezifischen Amplifikation bereits am Anfang der PCR führen, die zu Mischen oder falsch positiven Ergebnissen führt. Die thermisch initiierte PCR löst dieses Problem durch die Hinzufügung einer thermisch stabilen DNA-Polymerase in die PCR-Reaktion.

Der Schlüssel zur thermischen PCR ist die Verwendung einer Polymerase, die eine hohe Temperaturaktivierung erfordert. Solche Enzyme werden erst bei höheren Temperaturen aktiv und beginnen daher, die ZielDNA-Sequenz erst zu Beginn der Reaktion zu vergrößern, ohne eine unspezifische Reaktion bei niedrigen Temperaturen auszulösen.

Einige der häufig verwendeten thermisch initiierten Polymeren umfassen verbesserte Versionen der thermisch stabilen Taq-Polymerase, wie die Taq-DNA-Polymerase mit einer thermischen Aktivierungsdomäne, sowie hochfidelitäre Polymeren wie Pfu oder Phusion.

Derzeit erfüllen Enzyme im Wesentlichen alle Bedingungen.

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Prüfung der Laborumgebung:Vermeiden Sie die Verunreinigung von DNA und experimentellen Geräten, verwenden Sie sterile Techniken und behandelte Reagenzien, um das Labor sauber zu halten.

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Gradientoptimierte PCR:Verwenden Sie einen Temperaturgradienten, um eine PCR-Reaktion durchzuführen, um eine spezifisch verstärkte Temperatur zu finden.

Intelligentes 2D Gradient PCR-GerätIn der gleichen Reaktion können die Temperaturgradienten der Degradation und der Auskühlung gleichzeitig optimiert werden. Die horizontale 8-Liniengradiente können in der Länge 12-Säulen-Auskühlungstemperaturen eingestellt werden, um die optimale Auskühlungstemperatur zu optimieren und somit die Spezifizität und Effizienz der PCR-Reaktion zu verbessern.

Diese Technik ist sehr nützlich für die Optimierung von Primären, Schablonen und PCR-Bedingungen, um eine hohe Qualität und spezifische PCR-Produkte zu gewährleisten.

Diese Methoden können allein oder in Kombination verwendet werden, um zu helfen, die Probleme mit der PCR zu reduzieren oder zu beseitigen.