Fluoreszenz-Quantitative-PCR-Analyzer durch Echtzeit-Überwachung der Fluoreszenzsignaländerungen, die Kombination von Ct-Werten mit der Standardkurvenanalyse, um die genaue Quantifizierung von Genen zu erreichen, sind die Kernprinzipien und Umsetzungsschritte wie folgt:

Kernprinzipien

Fluoreszenzgruppen (wie SYBRGreen-Farbstoffe oder TaqMan-Sonden) in ein PCR-Amplifikationssystem hinzugefügt werden, um die Fluoreszenzsignalintensität synchron mit der Amplifikationsmenge zu ändern. Jeder Abschluss eines PCR-Zyklus erfasst das Instrument ein Fluoreszenzsignal und erzeugt eine Verstärkungskurve. Bestimmen Sie die Anzahl der Zyklen (Ct-Werte), wenn das Verstärkungsprodukt die Schwelle erreicht, indem Sie eine Fluoreszenzschwelle festlegen (in der Regel eine 10-fache Standardabweichung des Basissignals). Der Ct-Wert ist negativ mit der Anzahl der Startvorlagen korreliert, d. h. je mehr die Anzahl der Startvorlagen ist, desto kleiner ist der Ct-Wert.

Umsetzungsschritte

Standardkurvenkonstruktion: Gradientelle Verdünnung mit Standardprodukten in bekannten Konzentrationen wie reinigter Plasmid-DNA oder in vitro transkribierter RNA und PCR-Amplifikation mit Standardprodukten in unterschiedlichen Konzentrationen als Vorlage. Die Logarithmen der Standardkopienzahl als horizontale Koordinaten und der Ct-Wert als longitudinale Koordinaten zeichnen die Standardkurven. Wenn die Standardkonzentration im Bereich von 10² bis 10¹In In In der Regel zeigt die Schablonenkonzentration ein gutes lineares Verhältnis zu Ct-Werten (Korrelationskoeffizient R² > 0,99), um sicherzustellen, dass eine genaue Messung in diesem Bereich möglich ist.

Unbekannte Probentest: Die Anzahl der Kopien des Zielgens in der Probe wird anhand ihrer Ct-Werte durch die Standardkurvenformel vergrößert. Wenn die Standardkurvenformel z. B. y=3,1372x+38,201 ist (y für den Ct-Wert und x für den Logaritmus der Kopienzahl), kann die ursprüngliche Vorlagenmenge der Probe durch Umkehrberechnung ermittelt werden.

Endosengenkorrektur (relative quantitative): Wenn die Unterschiede in der Genexpression zwischen verschiedenen Proben verglichen werden müssen, wählen Sie das Gastgen (z. B. GAPDH, β-Actin) als Endosengen aus, berechnen Sie die Ct-Differenz zwischen dem Zielgen und dem Endosengen (ΔCt), und verwenden Sie die ΔΔCt-Methode zur Analyse der relativen Expression, um die Auswirkungen der Unterschiede in der Probengröße und der Reaktionseffizienz zu beseitigen.