DNA-Sequenzierung mit tropfenbasierter Mikrofluidik

Die Tropfenerzeugungstechnik ermöglicht es Forschern, große Studien mit minimalen Probenvolumen durchzuführen, was die DNA-Sequenzierung effizienter und kostengünstiger macht. Darüber hinaus kann es helfen, kleine intrazelluläre Variationen zu erkennen, die mit der Krebsdiagnose verbunden sind. Dieser Artikel diskutiert die Anwendung der Tropfenerzeugung in der DNA-Analyse und zeigt die grundlegenden Einstellungen, die für Experimente mit Tropfenmikrofluiden erforderlich sind.

1 Chancen und Herausforderungen der DNA-Analyse

Wissenschaftler analysieren die DNA, um Krebsmutationen zu erkennen, menschliche Antikörper zu charakterisieren und Mikroorganismen zu unterscheiden. Die DNA-Analyse umfasst eine Vielzahl von Techniken, einschließlich der Sequenzierung des Genoms mit bekannten Sequenzsonde-Arrays oder mit einer Next Generation Sequencing (NGS)-Plattform.

Die NGS-Plattform nutzt Chip-Arrays für massive Parallelanalysen, die Hunderte von Millionen Moleküle gleichzeitig erkennen können, was Kosten senkt und Effizienz erhöht [1].

Allerdings sind die analytischen Fähigkeiten herkömmlicher Chip-Arrays begrenzt und erfordern zusätzliche Flüssigkeitsbehandlungs- und Reagenzmischsysteme, die die Komplexität des experimentellen Prozesses erhöhen und den Gesamtdurchsatz begrenzen. Um die Sequenzierungskosten pro Basis zu senken, müssen in der Regel mehrere Proben parallel verarbeitet werden, und Barcode-Markierungen erhöhen zwar die Zeit des experimentellen Prozesses, obwohl sie dieses Problem teilweise lindern können.

2 Mikroflüssigkeitstechnik auf Tropfenbasis

Die Mikrofluidtropfentechnik besteht darin, diskrete Tropfen mit einer nicht mischbaren Phase (in der Regel Wasserphase und Ölphase) zu erzeugen und mit einer Mikrofluidpumpe die Produktion von Tropfen mit hoher Geschwindigkeit und Präzision zu steuern [3]. Zu den Hauptvorteilen gehören:

• Niedriger Probenvolumenbedarf

• Hoher Automatisierungsgrad

• Hoher Durchfluss

• Niedrigkosten

• Mikrofluide können das Flüssigkeitsvolumen schnell und präzise steuern und den Durchsatz der DNA-Analyse erhöhen. Zum Beispiel ermöglicht die Mikrofluidisierung der Tropfen die Erzeugung und Sortierung von Tausenden von Tropfen pro Sekunde [1].

Jeder Tropfen ist eine unabhängige Reaktionskammer und eignet sich für Anwendungen wie die digitale PCR-Molekülzählung, das Proteinkristallscreening und die Genexpressionsanalyse. Die Anzahl der Reaktionen kann mit zunehmender Tropfenerzeugungsrate vergrößert werden, während die Reduzierung des Tropfenvolumens den Reagenzverbrauch verringert und das Experiment flexibler macht [1].

Insgesamt kann die Technologie Hunderte von Millionen Reaktionen mit sehr geringem Reagenzverbrauch durchführen, was die Experimentaleffizienz erheblich erhöht und die Kosten senkt. Im Gegensatz zur Fixtpunkt-Detektion auf der Basis von Chip-Arrays fließen jedoch Tropfen in Mikrofluidkanälen und können das Ergebnis nicht durch Positionsinformationen markieren, weshalb zusätzliche Markierungsmethoden erforderlich sind [1].

3 Single-Cell-Genom-Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Traditionelle Sequenzierungstechniken sind in der Regel schwierig, kleine Variationen im Genom zu erkennen, daher verwenden Wissenschaftler die Sequenzierung des gesamten Genoms mit einer einzigen Zelle, um Kopienzahlvarianten und einzelne Nukleotidvarianten zu identifizieren.

Durch die Mikrofluidtechnik ist eine hochleistungsfähige, skalierbare Single-Cell-Sequenzierung möglich. Zum Beispiel verwendet eine Studie die Barcode-Marking-Technik, um die DNA des vergrößerten Genoms einzelner Krebszellen zu analysieren. Diese Methode ist in der Lage, Zellen mit pathogenen Mutationen während der Krebsremission zu erkennen und den komplexen Klonenvolutionsprozess von Tumoren mit akuter Myeloleukämie (AML) aufzudecken, Informationen, die herkömmliche Sequenzierungsmethoden nicht erfassen können [3]. Daher wird erwartet, dass die Technologie die Genauigkeit der Analyse der Heterogenität des Krebsgenoms verbessern und die individuellen Therapiestrategien optimieren kann [3].

4 Wie beginnt das Experiment?

Die Drop Microfluidics-Technologie bietet eine kostengünstige Methode zur DNA-Analyse mit hohem Durchsatz. Wenn Sie Experimente durchführen möchten, sind folgende Grundgeräte erforderlich:

2-3 Mikropumpen(oder eine Pumpe mit 2-3 Kanälen, wie eine 4U-Pumpe) - Steuern Sie den Fluss der kontinuierlichen Phase (Ölphase) und der Dispersionsphase (Wasserphase). Es wird empfohlen, eine 4U-Druckpumpe oder 2-3 ExiGo-Mikrofluidinspritzpumpen zu verwenden, bei denen die 4U-Druckpumpe für eine stabile und präzise Durchflussregelung über 4 Kanäle unabhängig gesteuert werden kann.

• 2-3 StückDurchflusssensoren- Überwachung des Öl- und Wasserflusses in Echtzeit, um die Stabilität der Flüssigkeit zu gewährleisten.

• Mikro-Fluid-Chip- Erzeugung von Tropfen und Gewährleistung der Kontrolle der Größe der Tropfen.

• Stabile KanäloberflächenchemieVerbesserung der Stabilität der Tropfen.

• Oberflächenaktiv- Stabilisieren Sie die Öl-Wasser-Schnittstelle und verbessern Sie die Stabilität der Tropfen.

• ÖlphaseVerbesserung der Stabilität der Tropfen.

• RohrleitungVerbinden Sie die Pumpe mit dem Microfluidics-Chip.

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Referenzen

1. Abate, Adam R et al. “DNA Sequenzanalyse mit tropfenbasierter Mikrofluidik.” Labor auf einem Chip Vol. 13,24 (2013): 4864-9. Doi:10.1039/c3lc50905b

2. Pellegrino, Maurizio et al. “Hochdurchsatz-Einzell-DNA-Sequenzierung von akuten Myeloid-Leukämie-Tumoren mit Tropfenmikrofluidik.” Genomforschung vol. 28,9 (2018): 1345-1352. Doi:10.1101/gr.232272.117

3. Sohrabi, S., & Moraveji, M. K. (2020). Tropfenmikrofluidik: Grundlagen und ihre fortgeschrittenen Anwendungen. RSC Advances, 10(46), 27560-27574.