Die häufigsten Probleme, die im Experiment auftreten können, umfassen hauptsächlich schwache oder keine Signale, hohe Hintergründe, Multiband-Phänomene, Bandabnormalitäten usw., Hier ist eine detaillierte Analyse dieser Probleme:
Schwaches oder kein Signal
1. Anti und 2. Nicht übereinstimmend: Der 2. Anti muss die gleiche Art sein wie der 1. Anti-Wirt, z. B. der 1. Anti stammt von einer Ratte, der 2. Anti-Ratte-Antikörper sein sollte.
Unterkonzentration von Antikörpern: Verwenden Sie hohe Konzentrationen von Antikörpern und verlängern Sie die Inkubationszeit unter 4 ° C-Bedingungen, wie z. B. Übernachtung.
Kreuzreaktion von Schließmitteln und Antikörpern: Verwenden Sie mildes Entverschmutzungsmittel wie Twain-20 oder ersetzen Sie Schließmittel (wie Entfettungsmilchpulver, BSA, Serum, Gelatine).
Ein Protein gegen nicht zu erkennende Arten: Vergleichen Sie die Immunogen- und Proteinsequenzen nach der Anleitung, um sicherzustellen, dass Antikörper und Zielproteine reagieren und eine positive Kontrolle festlegen.
Mangelnde Proteinmenge: Die Probenmenge pro Schwimmwegsprotein ist in der Regel nicht größer als 20 μg, Protease-Inhibitoren verwendet und eine positive Kontrolle eingestellt.
Transformation ist nicht ausreichend: Verwenden Sie reversible Farbstoffe, um den Transformationseffekt zu erkennen, um zu überprüfen, ob die Transformationsfunktion korrekt ist, z. B. PVDF-Membrane müssen vorab in Methanol eingetaucht werden und dann in den Transformationspuffer eingetaucht werden.
Anti-Ausfall: Verwenden Sie frische Antikörper, um eine Wiederverwendung zu vermeiden, die zu einer Verringerung der effektiven Konzentration führt.
Binäre Anti-Stapelnatrium-Unterdrückung: Vermeiden Sie die Verwendung von Stapelnatrium und HRP-markierten Antikörpern.
Testkits verfallen oder Substrat deaktiviert: Verwenden Sie frisches Substrat.
Hoher Hintergrund
Nicht oder unzureichend spezifische Schließungen: Verlängern Sie die Schließzeit und erwägen Sie den Austausch eines geeigneten Schließmittels.
I- oder II-Antikonzentrationen sind zu hoch: Verdünnen Sie Antikörper auf eine geeignete Konzentration oder verlängern Sie die Inkubationszeit mit höheren Antikörpern.
Bindungen oder Reaktionen nicht spezifisch mit dem Schließmittel: Setzen Sie eine binäre Kontrolle ein (nicht plus 1).
Nicht gebundenes Proteinwaschen ist unzureichend: Erhöhen Sie die Anzahl der Wäsche.
Membrantrocknen: Verhindern Sie das Trocknen der Membran während der Inkubation, jeder Schritt muss sicherstellen, dass die Membran eine ausreichende Reaktionsflüssigkeit hat, die in den Rührer gesetzt werden kann, um ständig zu rühren oder leicht zu schocken, um die Membran in die Lösung einzutauchen.
Unsachgemäße Filmauswahl: Nitrate Cellulose-Membran (NC-Membran) ist niedriger als PVDF-Membranhintergrund und kann entsprechend den experimentellen Anforderungen die geeignete Membran auswählen.
Vielfältiges Phänomen
Die Zahl der Zellgenerationen ist zu hoch und die Proteinexpression ist unterschiedlich: Parallel kontrollierte Experimente mit den ursprünglichen, nicht übertragenen Zellstämmen und den aktuellen Zellstämmen werden durchgeführt.
In vivo exprimierte Proteinproben haben eine Vielzahl von Modifikationsformen: wie Acetylierung, Methylierung, Alkylierung, Phosphorylierung, Glykoxylierung usw., Reagenzien können verwendet werden, um die Probe zu dephosphorieren, zu entglykoxylieren, um die Modifikation nach der Translation zu beweisen.
Proteinabbau der Probe: Fügen Sie ausreichend Protease-Inhibitoren in den Probenpuffer hinzu.
Neue Proteine, die nicht gemeldet wurden, oder Proteine mit ähnlichen Epitopen in derselben Proteinfamilie zu erkennen, die unterschiedlich strukturiert sind: Überprüfen Sie andere Literaturberichte oder verwenden Sie die BLAST-Suche mit den empfohlenen Zellstämmen oder Geweben in der Anleitung.
Überhohe Antikörperkonzentration: Senkung der Antikörperkonzentration und / oder Inkubationszeit.
Band ungewöhnlich
Hintergrund hat ungleichmäßige weiße Flecken: Blasen oder Antikörper sind ungleichmäßig auf der Membran verteilt, während der Transformation sollte man versuchen, die Blasen zu entfernen, während der Inkubation des Antikörpers geschüttelt wird.
Der Hintergrund hat schwarze Flecken: Antikörper binden sich an das Verschlussmittel und können das Verschlussmittel filtern.
Weiße Streifen auf dem tiefen Hintergrund erscheinen: eine oder zwei Antikörper zu viel hinzugefügt, sollte die Konzentration des Antikörpers verdünnt werden.
Der Zielstreifen ist zu niedrig / zu hoch gefärbt, die Trennung ist nicht vollständig: Ändern Sie das Gelverhältnis, ein großes Molekulargewicht mit niedriger Konzentration von Kleber, ein kleines Molekulargewicht mit hoher Konzentration von Kleber.
Streifen-Lächeln-Effekt: Eine zu schnelle Migration oder eine zu hohe Elektrophoresentemperatur verändert den pH-Wert und die Migrationsgeschwindigkeit, was die Migrationsgeschwindigkeit oder die Elektrophorese bei niedriger Temperatur verlangsamen kann (z. B. in einer kalten Lagerung oder auf Eis).
Ungleichmäßige Streifen der gleichen Protein-Hybridisierung erscheinen: Das Gel koaguliert zu schnell bei der Vorbereitung des Gels, so dass der Anteil des Acrylamids in der Schwimmbahn ungleichmäßig ist, können Sie sich auf die Rezeptur des Gels beziehen, die angemessene Menge TEMED in das Gel hinzufügen, die angemessene Menge 1% SDS (Wasserverdünnung) auf der Spitze des Gels hinzufügen, um zu verhindern, dass das Gel trocknet.