In der Welt der Mikroporenplatten ist Licht ein Maßstab undEnzym-FilterDie Skala. Das Enzym-Calibrator "stellt Fragen" durch eine bestimmte Wellenlänge und die Probe "beantwortet" mit Absorption oder Fluoreszenz. Hinter den scheinbar einfachen Werten steht eine Reihe von wiederholt überprüften „Grundwellenlängen“, die wie internationale Vokalen Daten verschiedener Marken und unterschiedlicher Labore übersetzen können. Das Verständnis der Herkunft und des Gebrauchs dieser Wellenlängen ist der erste Schritt zur Gestaltung von Experimenten und zur Behebung von Anomalien.
Die "alten drei" Aspekte der sichtbaren Absorption machen immer noch 90% des Tages aus: 405 nm, 450 nm und 620 nm. 405 nm von der maximalen Absorption von Nitrophenol (pNP) in der alkalischen Phosphatase (ALP) Substrat ist die Kernlesung des ELISA Gold Standard Binary System; 450 nm entsprechen dem Endprodukt der TMB-Färbung durch die Katalyse von Moringa Peroxidase (HRP) und sind fast zur "universellen Währung" im Immundetect geworden. Bei 620 nm handelt es sich nicht um den Spitzenpunkt der Probe, sondern um den blauen Boden, der nach der Beendigung des TMB zurückbleibt, der zur Korrektur von Leeren verwendet wird, um die Unterschiede zwischen Kratzern und Pipettierung der Plattenboden abzuziehen und den Batch-CV auf <5% zu erhöhen.
Wenn das Experiment in die Beurteilung des Stoffwechsels oder der Zellvinabilität eintritt, verschoben sich die Wellenlänge sofort rot. 490 nm und 570 nm gepaart, können MTS und MTT Panzerprodukte jeweils gelesen werden; Die Hersteller kontrollieren die halbe Bandbreite des Filters auf 10 nm, um mitochondriale Yellowin-Störungen zu vermeiden. Um die durch Membranschäden freigegebene Lactsäuredehydrogenase (LDH) zu erkennen, schaltet man auf 340 nm um die Oxidationsrate von NADH zu überwachen, diese Wellenlänge ist temperaturempfindlich und das Instrument benötigt ein eingebautes thermostatisches Modul von ≤0,1 ° C, um die Linearität von ΔOD min-¹ zu gewährleisten.
Die grundlegende Wellenlänge für Fluoreszenzanwendungen konzentriert sich auf die "Stokes-Verschiebung". Anregung von 485 nm / Emission von 528 nm ist die "goldene Kombination" von Fluorescenz (FITC) und wird weit verbreitet für die Markierung von Zellhaftung mit Antikörpern; Bei der Verbesserung des Durchflusses wird das APC-Cy5-System mit 630 nm Stimulation und 670 nm Emission häufig verwendet, um die spontane Fluoreszenz des Kulturmediums zu vermeiden und eine Empfindlichkeit von 0,2 fmol pro Welle in 384-Loch-Platten zu erreichen. Für die Nukleensäure-Quantifizierung erfordert die Anregung von 260 nm / Emission von 380 nm Quarzfasern und UV-Filter, um tiefe UV-Alterung zu verhindern, die zu einer Verletzung der Durchlässigkeit führt.
Wartung, obwohl diese Filter mit einer harten Folie beschichtet, die Lebensdauer von Zehntausenden von Malen, aber die Oberfläche Fingerabdruck oder Ethanol-Rückstände streuen den Lichtweg, so dass die leere OD erhöhen 0,01, kann zu einem hohen Wert der Probe falsch beurteilen als "übertroffen". Daher ist das tägliche Abwischen mit reinem Wasser und einer halbjährlichen Wellenlängenkalibrierung ein grundlegendes, aber entscheidendes SOP.
Kurz gesagt, die grundlegende Wellenlänge ist keine zufällige Zahl, sondern eine "Standard-Schnittstelle", die sich mit chemischen Substraten und Biomolekülen entwickelt. Wenn man sie beherrscht, kann das Enzym-Calibrator wirklich ein "Spektrophotometer in einer Mikroporenplatte" werden, die jedem 0,001 OD eine wiederholbare wissenschaftliche Bedeutung verleiht.