Einer,PolypeptidsynthesizerTechnische Grundsätze: Kernlogik der Festphasenpolypeptidsynthese (SPPS)
Der Polypeptidsynthesizer basiert auf der von Bruce Merrifield im Jahr 1963 vorgeschlagenen Methode der Festphasenpolypeptidsynthese (SPPS), deren Kern darin besteht, die Peptidkette zu verlängern, indem das Aminosäure-C-Ende an einem Harzträger befestigt wird und die Aminosäure, die das N-Ende schützt, nacheinander hinzugefügt wird. Die konkreten Schritte sind wie folgt:
Harz Vorbehandlung
Wählen Sie einen geeigneten Festphasenträger wie Rink Amide Resin aus, lösen Sie das Harz mit Dichlormethan (DCM) auf und trocknen Sie das Ersatz nach der Entfernung der Verunreinigungen.
Entschützen
Entfernen Sie die Fmoc-Schutzgruppe der vorherigen Aminosäure mit einem alkalischen Lösungsmittel wie einer 20%igen Hexahydropyridin-/DMF-Lösung, um die Aminosäuren zur Teilnahme an der nächsten Reaktion zu exponieren.
Verknüpfte Reaktion
Neue Aminosäuren (N-End-Schutz) werden mit Aktivierungsmitteln (wie HBTU, DCC) gemischt, um einen aktiven Ester zu bilden und in den Reaktor eingebracht, um sich mit den abgeschützten Aminosäuren zu binden, um eine Peptidbindung zu bilden.
Waschen und Reinigen
Nach jedem Schritt der Reaktion mit Lösungsmitteln wie DMF und Methanol gewaschen werden, um unreaktierte Rohstoffe und Nebenprodukte zu entfernen und die Anhäufung von Verunreinigungen zu reduzieren.
Spaltung und Freisetzung
Nach Abschluss der Synthese wird das Polypeptid mit einer Lyese wie Trifluoressigsäure (TFA) vom Harz abgeschnitten und das grobe Peptid durch Ausfällung von Ether, Zentrifugierung und Trocknung erhalten.
Technische Vorteile:
Automatisierung: Reduzierung manueller Fehler und Verbesserung der Wiederholbarkeit.
Effiziente Reinigung: Festphasenträger lassen sich leicht trennen und vermeiden komplexe Zwischenstoffreinigungsschritte bei der Flüssigphasensynthese.
Produktion in großem Maßstab: Unterstützung der Milligramm- bis Grammsynthese, um die Bedürfnisse der Arzneimittelforschung und -entwicklung zu erfüllen.
Schlüsselkomponenten und Funktionen: Hardwaregrundlage für präzise Steuerung
Das Hardwaredesign des Polypeptidsynthesizers beeinflusst direkt die Effizienz der Synthese und die Reinheit des Produkts. Die Kernkomponenten umfassen:
Reaktor
Material: Glas oder Polypropylen, chemische Korrosionsbeständigkeit.
Kapazität: Abdeckung von 30 μmol (kleine Studien) bis 3g Harz (industrielle Produktion).
Mehrkanäle-Design: Unterstützt die parallele Synthese von 2/4/6 Kanälen und erhöht die hohe Durchflusskapazität.
Lösungsmittelfördersystem
Automatisches Fördermodul: Präzise Steuerung der Durchflussgeschwindigkeit von Lösungsmitteln wie DMF, DCM (Fehler < 1%).
Schutz gegen inerte Gase: Isolierung von Sauerstoff durch Stickstoff/Argon zur Verhinderung der Aminosäure-Oxidation.
Temperaturkontrollmodule
Genauigkeit: ± 0,5 ° C, die Nebenreaktionen der Desynkulation reduzieren.
Bereich: Raumtemperatur bis 60 ° C, die sich an die Entfernungsbedingungen verschiedener Schutzgruppen anpassen.
Inspektions- und Kontrollsysteme
UV-Überwachung: Erfassung der Absorptionsfähigkeit der Reaktionsflüssigkeit in Echtzeit und Bestimmung der Entschutz-/Kopplungsendpunkte.
Massenspektrometrie: Optionale Online-Massenspektrometrie zur Bestätigung der Produktstruktur in jedem Schritt.
Drei,PolypeptidsynthesizerBetriebsprozess: Die gesamte Kette von der Reagenzvorbereitung bis zur Produktreinigung
Kalibrierung und Vorbereitung von Geräten
Prüfen Sie, ob die Lösungsmittelspeicherflasche an die Gasleitung angeschlossen ist, um sicherzustellen, dass keine Leckagen vorliegen.
Kalibrieren Sie Temperatur, Druck, Abnahmenadeln und andere Parameter und führen Sie ein Selbstprüfverfahren durch.
Reagenzien und Materialvorbereitung
Wagen von Aminosäuren, Aktivierungsmitteln (wie HBTU), Lösungsmitteln (DMF, DCM).
Das Harz wird in den Reaktor hinzugefügt und mit DCM aufgeblasen getrocknet.
Einstellungen für das Syntheseprogramm
Geben Sie die Polypeptide-Sequenz ein und stellen Sie die Reaktionsbedingungen fest (Temperatur, Zeit, Lösungsmittelanteil).
Beispiel: Fmoc Entschützung (20% Pipidin / DMF, 5 min x 2 mal); Die gekoppelte Reaktion (3-fache Überdosis von Aminosäuren, 1 Stunde).
Automatisierte Synthese
Starten Sie das Programm und das Gerät führt den Entschützungs-, Kopplungs- und Waschzyklus automatisch durch.
Überwachen Sie Reaktionsprozesse wie UV-Absorption nach der Stabilität zum nächsten Schritt.
Produktspaltung und Reinigung
Zugabe des Lysats (TFA/Wasser/Triisopropylsilan = 95:2,5:2,5) und Rühren bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
Das Harz wird durch Filtern entfernt und das grobe Peptid mit Ether ausgefällt.
Durch HPLC (High Efficient Fluid Chromatography) wird ein Polypeptid mit hoher Reinheit (> 95%) gereinigt.