Der Proteinstabilitätsanalysator PSA-16 hilft Forschern des nationalen lokalen gemeinsamen Ingenieurlabors für Antikörperentwicklungstechnologien der Universität von Henan im März 2025 in der Zeitschrift "International Journal of Biological Macromolecules" das Papier "Attenuation of cardiac ischemia/reperfusion injury via the decoy receptor DcR2 by targeting the PLAD domain of the death receptor DR5" zu veröffentlichen.

Diese Studie zielt darauf ab, die Wirkungsziele von DcR2 zu bestimmen und den kardiomuskulären Schutzmechanismus von DcR2 bei I/R-Schäden des Herzmuskels in Mäusen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass das hDcR2-Fc-Fusionsprotein eine signifikante schützende Wirkung auf kardiomuskuläre Ischämie / Reinfusionsverletzungen hat. DcR2 bildet über seine PLAD-Domäne einen heterogenen Komplex mit DR5, der keine vollständige Totdomäne besitzt und daher kein Signal nach unten senden kann. Darüber hinaus verdeckt die Bildung des Komplexes die Stellen, an denen der Ligand TRAIL interagiert, wodurch der Herzmuskeltod nach einer Ishämie / Reinperfusionsverletzung verringert wird. Daher zeigt diese Studie, dass die PLAD-Domäne von DcR2 eine entscheidende Rolle bei der Hemmung der Apoptose spielt und ein potenzielles Ziel für die Entwicklung neuer Medikamente bietet.

Lijie Zhang, Xinyuan Zhang, Ziting Li, Tingting Mo, Feng wollen, JingLun Zhang, Dan Zhao, Ying Wang, Yinxiang Wei, Yaohui Wang

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering, das erste angeschlossene Krankenhaus, Henan University, Kaifeng, China

Medizinische Fakultät, Henan Universität, Kaifeng, China

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering, Henan University, Kaifeng, China

Zhou, D. et al.

Die thermische Stabilität des Proteins bezieht sich auf die Formungsfähigkeit der Protein-Polypeptidkette unter Temperatureinwirkung, die sich hauptsächlich in den chemischen Eigenschaften der Polypeptidkette und den Änderungen der räumlichen Konfiguration bei Temperaturänderungen widerspiegelt, je kleiner die Änderung, desto höher ist die thermische Stabilität. Die thermische Stabilität von Proteinen wird von äußeren Faktoren wie unterschiedlichen Temperaturen, pH-Werten und Ionenstärken beeinflusst und ist in den Bereichen Biotechnologie, Medikamentenentwicklung und Lebensmittelindustrie von großer Bedeutung.

Die Temperatur der Proteinedegeneration ist ein wichtiges Konzept für die Biologen, die die thermische Stabilität von Proteinen untersuchen, was sich auf den Temperaturpunkt bezieht, an dem sich die Struktur des Proteins unter bestimmten Temperaturbedingungen ändert, und wenn die Temperatur im Allgemeinen höher ist, ändert sich das Protein von einer stabilen dreidimensionalen Struktur in eine lose unordnete Struktur. Die thermische Stabilität eines Proteins wird in der Regel durch die Temperatur des Mittelpunkts der thermischen Degradation (Tm) ausgedrückt, d. h. die Temperatur, wenn das Protein um 50% gefaltet wird.

01 Vorwort

Der Herzmuskelstod durch ischemische Sauerstoffmangel ist die Hauptursache für Herzmuskelschäden. DcR2 ist ein Trickrezeptor von TRAIL, und die Rolle von DcR2 bei kardiomuskulärer Ischämie / Reinperfusion (I / R) Verletzungen ist unklar. Jüngste Studien haben gezeigt, dass DcR2 nicht nur als Rezeptor an TRAIL bindet, sondern auch als Ligand für DR5 die TRAIL-induzierte Apoptose in vitro blockiert, aber die Affinitätspräferenz von DcR2 für TRAIL oder DR5 in vivo ist unklar. Frühere Studien fanden heraus, dass das hDcR2-Fc-Fusionsprotein eine kardioprotektive Rolle im I/R-Verletzungsmodell der Mäuse spielt, indem die Apoptose reduziert wird. Die Affinitätsmessungen zeigen, dass DcR2 eine größere Affinität für DR5 hat als für TRAIL und dass DcR2 eher an DR5 bindet. Mechanismus-Studien haben gezeigt, dass das Fehlen von PLAD die schützende Wirkung von hDcR2-Fc auf I / R verursachte Herzmuskelschäden eliminiert. DcR2 bildet einen heterogenen Komplex über eine ähnliche PLAD-Domäne wie DR5. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass DcR2 DR5 über die PLAD-Domäne zur Bildung eines heterogenen Komplexes abzielt und die Apoptose blockiert, wodurch die I/R-Verletzung des Herzmuskels verbessert wird, was eine neue Präventionsstrategie für die Behandlung von I/R-Verletzungen des Herzmuskels bietet.

02 Zusammenfassung

Akuter Myokardieinfarkt (AMI) ist eine ernsthafte menschliche Gesundheitsbedrohung und die Sterblichkeitsrate an AMI ist weltweit nach wie vor hoch. Der Tod von Herzmuskelzellen durch Ishämie-Sauerstoffmangel ist eine irreversible Schädigung. Die Transkutale Koronare Interventionstherapie (PCI) kann die Sterblichkeit bei Patienten mit akuten Myokardieinfarkten effektiv reduzieren, aber es gibt zwei große Probleme, nämlich die kurze goldene Behandlungszeit und die Schädigung durch Ischämie / Reinperfusion (I / R). Darüber hinaus ist die Inzidenz von langfristiger Herzinsuffizienz hoch. Um den Umfang eines Herzinfarkts zu verkürzen, die „Fensterphase“ des Herzmuskeltodes zu verlängern und die langfristige Prognose des Patienten zu verbessern, sind neue Therapien erforderlich, die Herzschäden reduzieren oder umkehren können.

Ein Herzinfarkt wird in der Regel von mehreren pathologischen Veränderungen begleitet, von denen die schwerste die Apoptose ist. Allerdings gibt es keine klinisch wirksame Strategie zur Behandlung der Apoptose. Daher könnte die Suche nach Schlüsselzielen zur Prävention von Herzmyokaptose neue Strategien zur Prävention und Behandlung von Herzinfarkten bieten. Der TNF-assoziierte Apoptose-induzierende Ligand (TRAIL), auch Apo2-Ligand genannt, gehört zur TNF-Ligand-Superfamilie. Bisher wurden fünf TRAIL-Rezeptoren identifiziert. DR4 (TRAIL-R1) und DR5 (TRAIL-R2) werden als Todesrezeptoren (DRs) bezeichnet und verfügen über eine vollständige Todesdomäne (DD), die in der Lage ist, durch TRAIL regulierte Todesignale zu übertragen. DRs vermitteln die Aktivierung der entsprechenden nachgelagerten Signalwege, was zu einer Apoptose führt, bei der DR5 der primäre Todsrezeptor ist.AutorFrühere Studien haben bestätigt, dass das sDR5-Fc-Fusionsprotein den TRAIL-DR5-Weg spezifisch blockiert, wodurch die Herzfunktion nach einem Herzinfarkt bei Affen, Schweinen und Ratten verbessert wird.

03 Ergebnisse

Um festzustellen, ob PLAD die Bindung von DcR2 und DR5 vermittelt,AutorDas fehlende DcR2ΔPLAD-Fc-Fusionsprotein wurde hergestellt. Die Entfernung der PLAD-Domäne beeinflusst die sekundäre Struktur von DcR2 nicht, aber seine Schmelztemperatur (Tm) sank leicht, was darauf hindeutet, dass seine Stabilität vermindert wurde. Anschließend wurde die Affinität von DcR2APLAD-Fc mit TRAIL auf 4,724 x 10-7 M bestimmt, etwas niedriger als der wilde Typ. Die Ergebnisse der Apoptose blockierenden Experimente zeigten, dass DcR2 die Apoptose nach der Entfernung der PLAD-Domäne nicht blockieren konnte, was die Bedeutung der PLAD-Domäne bestätigt.

Mit dem Proteinstabilitätsanalysator PSA-16 führten die Autoren eine thermische Stabilitätsanalyse von NiV G-Ferritin und NiV sG durch Differential Scanning Fluorimetry (DSF) durch und zeigten, dass NiV G-Ferritin und NiV sG eine ähnliche thermische Stabilität mit einem Tm von ~ 65 ° C aufweisen, was darauf hindeutet, dass die Fusion von NiV G und Ferritin keine signifikanten Auswirkungen auf ihre strukturelle Stabilität hat.

Da NiV G-Ferritin eine flüssige Immunreaktion induzieren kann, wurden auch Mäuse mit NiV G-Ferritin-Immunität gescreent und eine Reihe monoklonaler Antikörper (mAb) hergestellt. Von den 27 mAbs, die isoliert wurden, können 25 mAbs wirksam eine Infektion mit einem NiV-Pseudo-Virus hemmen, das als Skelett des Follicular Oratitis Virus (VSV) verwendet wird, mit einer Konzentration (IC50), die erforderlich ist, um 50% der NiV-Pseudo-Virusinfektion zu hemmen, unter 10 ng / ml. Die Konkurrenzanalyse der Epitope ergab, dass die 27 mAbs, die screent wurden, vier verschiedene Antigen-Epitope auf dem NiV G-Protein identifizieren konnten, darunter zwei neue, bisher nicht berichtete Epitope. Schließlich bewerteten die Forscher die durch NiV G-Ferritin induzierte Immunantwort und die schützende Wirkung in einem tödlichen Modell einer Nipa-Virusinfektion (Syrischer goldener Hamster). Die Studie ergab, dass nach der Verabreichung von Hamstern mit zwei oder drei NiV-G-Ferritin, die Hamster produziert High School und aktives Serum, und die Impfung 2 oder 3 Mal half, die Hamster 100% gegen die tödliche Dosis NiV-Angriffe. Die Forscher untersuchten den viralen RNA-Gehalt in drei Impfstoffen und fanden heraus, dass keine virale RNA in der Lunge, dem Gehirn und der Milz des Hamsters nachgewiesen wurde, was darauf hindeutet, dass drei Dosen NiV G-Ferritin die Reproduktion des Virus in der Lunge, dem Gehirn und der Milz des Hamsters unterdrückten.

04 Methoden

Differential Scanning Fluoreszenzmethode

Die thermische Stabilität des Zielproteins wurde mittels der Differential Scanning Fluorimetry (DSF) mit dem PSA-16-Instrument (Beijing Best Technology Co., Ltd.) bestimmt. Die Probe wird auf 0,5 mg/ml verdünnt und die 20 μL verdünnte Probe in ein Quarzglasrohr geladen. Mit einem linearen Temperatur-Scan von 23 bis 97 ° C wurde die Fluoreszenz-Intensität (F) von 330 nm und 350 nm des Zielproteins bei 280 nm UV-Anregung mit einer Erwärmungsgeschwindigkeit von 1 ° C / min dynamisch in Echtzeit gemessen. Berechnen Sie den thermischen Übergangsmittelpunkt (Tm) anhand der Neigung der F350nm/F330nm-Kurve. Jede Probe wird viermal parallel gemessen.

Partikelgrößeneinschlusschromatografische Streuung (SEC-MALS)

100 µL Volumen pro Probe (NiV g-Ferrin 0,5 mg/mL, 2 mg/mL) mL (NiV sG) wurden in die WTC-030S5-Chromatografie-Säule (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) injiziert und 0,5 mL/min mit 20 mMTris-HClpH8,0 und 150 mmnacl als mobile Endstufe bei isothermer Laufzeit durchgeführt. Ein MALS-Detektor (DAWN) ®) Mit einem Brechungsindex-Detektor (RI) (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) in Serie mit einem UV-Detektor auf dem SEC-System verbunden. Rinderserum-Protein (BSA unter Verwendung von Scientific) normalisiert statische Lichtstreuungsdetektoren. Lichtstreuung, Differenzbebrechungsgrad (dRI) Messung und Moleküle mit ASTRA Software (6.1.2.84) (Wyatt Technology).

Enzymverbindeter Immunabsorptionstest (ELISA)

Die Antigenresistenz des NiV g-Ferroproteins wird durch ELISA nachgewiesen. Einfach gesagt, 96 - verpackt mit 3 μg / ml NiV bei 4 ° C durch eine ELISA-Platte (Corning) über Nacht mit sG oder NiV g - Ferrin beschichtete Puffer (0,1 Mcarbonate, pH 9,6). Nach vier Spülen einmal mit PBS-T (PBS enthält 0,05% Tween 20), wurden alle Löcher verstopft und wirken 2 h bei 37 ° C mit 50 μL Blockierungspuffer (1% BSA in PBS-T). Nach Blockierung, NiV G-Monob gegen HENV-32, HENV-26, nAH1.3, Anti-Rabies Virus-Monob RVC20 (negative Kontrolle) wurde ab 5 μg / ml verdünnt, 2 h PBS-T bei 37 ° C zu inkubieren und 4 mal zu waschen, dann HRP-gebundenen Ziegen-Antikörper IgG (1: 20.000 verdünnt, ab-Klon, AS002) hinzugefügt, um 1 h bei 37 ° C zu bewahren. Die Platte wurde 10-30 Minuten bei 37 ° C mit 50 μL / Loch einkomponentigem TMB-Detektor gespült. Substratreaktion 1M HCl mit 50 μL/Loch, Absorption gemessen bei 450 nm (OD450). Für die Serum-Bindung-Titertest,Autor genehmigtG-Headproteine von NiV-M, NiV-B und NiV-B verpacken HeV, LayV und MojV auf eine ELISA-Platte, HRP gekoppelt mit Ziege-Anti-Maus-IgG (1: 8000 verdünnt, ab-Klon, AS003)。

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05 Zusammenfassung

Zusammenfassend entwickelte die Studie erfolgreich einen neuen Nanopartikel-Impfstoff mit NiV G-Protein-Kopfdomein als Antigen-Ziel, Ferritin als Demonstrationsplattform und isolierte eine Reihe von monoklonalen Antikörpern mit potenziellen therapeutischen Wirkungen. Die Forschung liefert neue Erkenntnisse für ein tieferes Verständnis der Immunogenität des NiV-G-Proteins, und NiV-G-Ferritin verspricht die Weiterentwicklung eines breiten Spektrums von Impfstoffkandidaten für das Hennipa-Virus und bietet neue Schutzstrategien für die globale öffentliche Gesundheitssicherheit.

Zhao Haiyang, Forscher des Nationalen Schlüssellaboratoriums für Virologie an der Universität von Wuhan, und Deng Zhangqin, Forscher des Instituts für Virenforschung von Wuhan der chinesischen Akademie der Wissenschaften, sind Co-Kommunikationsautoren des Papiers. Dr. Zhou Dan, Doktorand der Fakultät für Lebenswissenschaften der Universität Wuhan, Dr. Yangfeng Yao, Senior-Experimentalist des Virusinstituts von Wuhan der chinesischen Akademie der Wissenschaften, sind Co-Erstautor der Dissertation.

Die Forschung wurde durch das nationale Forschungs- und Entwicklungsprogramm, das Programm für junge Talente des Gesundheitskomitees der Provinz Hubei und das Programm für Talente auf akademischer Ebene der chinesischen Akademie der Wissenschaften finanziert und von dem Nationalen Biosicherheitslabor von Wuhan und dem Nationalen Schlüssellabor für Virologie von Wuhan unterstützt.

Original-Link: https://www.nature.com/articles/s41541-024-00954-5

Mit Hilfe des eigenständig entwickelten Proteinstabilitätsanalysators PSA-16 von Beijing Best Technology Co., Ltd., führten die Autoren die thermische Stabilitätsanalyse von NiV G-Ferritin und NiV sG durch das Prinzip der Differential Scanning Fluorimetrie (DSF) durch. Die Ergebnisse zeigten, dass NiV G-Ferritin und NiV sG eine ähnliche thermische Stabilität zeigen, Tm von ~ 65 ° C, was darauf hindeutet, dass die Fusion von NiV G und Ferritin keine signifikanten Auswirkungen auf ihre strukturelle Stabilität hat.